摘要：【目的】馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是危害煙草、馬鈴薯、番茄、辣椒等主要農(nóng)作物的重要病毒,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大損失。論文旨在克隆Hsc70-2蛋白在本氏煙(Nicotiana benthamiana)中的基因序列并分析其生物學(xué)信息,研究NbHsc70-2蛋白對(duì)PVY侵染煙草的影響,為進(jìn)一步解析PVY的侵染機(jī)制提供理論依據(jù)。【方法】以本氏煙為材料,克隆NbHsc70-2蛋白的基因編碼序列(coding sequence,CDS),利用MEGA 6.0進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹;利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析NbHsc70-2在本氏煙各組織中的表達(dá)水平;采用在線軟件BaCeILo和SignalP 4.0對(duì)NbHsc70-2進(jìn)行生物信息學(xué)分析;構(gòu)建NbHsc70-2-RFP融合蛋白確定該蛋白的亞細(xì)胞定位;研究PVY處理對(duì)本氏煙葉片中NbHsc70-2的影響;利用激光共聚焦觀察PVY-GFP處理對(duì)NbHsc70-2-RFP定位的影響;構(gòu)建NbHsc70-2 VIGS沉默體系及瞬時(shí)表達(dá)載體,采用qRT-PCR比較NbHsc70-2在沉默/過表達(dá)后對(duì)PVY表達(dá)的影響。【結(jié)果】NbHsc70-2編碼649個(gè)氨基酸,系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明,NbHsc70-2與普通煙NaHsc70-2序列相似性最高,親緣關(guān)系最近,屬于熱激蛋白家族,C端具有熱激蛋白家族的高度保守基序結(jié)構(gòu);qRT-PCR分析表明,NbHsc70-2在葉中表達(dá)量最高,在根和莖中的表達(dá)量較低;BaCeILo預(yù)測(cè)及激光共聚焦顯微鏡觀察均顯示NbHsc70-2定位在細(xì)胞質(zhì)中,并且PVY-GFP侵染本氏煙后NbHsc70-2-RFP部分轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核,與PVY-GFP共定位在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中;將NbHsc70-2基因沉默載體pTRV::NbHsc70-2導(dǎo)入本氏煙中7 d后相比于對(duì)照組,沉默組出現(xiàn)心葉皺縮及矮化現(xiàn)象;接種PVY-GFP 7 d后通過手持紫外燈觀察到沉默組中無明顯綠色熒光出現(xiàn),而對(duì)照組中PVY-GFP系統(tǒng)侵染使得非接種葉片呈現(xiàn)熒光現(xiàn)象,沉默組熒光點(diǎn)數(shù)約為對(duì)照組28%;接種PVY后,利用qRT-PCR檢測(cè)沉默NbHsc70-2后1、3、5 d的PVY CP基因積累量,結(jié)果表明沉默NbHsc70-2后PVY CP基因積累量下降,其中3 d和5 d與對(duì)照相