時間：2023-03-02 14:57:32
導語：在音標學習計劃的撰寫旅程中，學習并吸收他人佳作的精髓是一條寶貴的路徑，好期刊匯集了九篇優秀范文，愿這些內容能夠啟發您的創作靈感，引領您探索更多的創作可能。
關鍵詞：血液集中化檢測；標本；質量；無償獻血；分析
選擇低危的無償獻血是安全血液的關鍵環節，而然，血液檢測仍然是血液安全保障的重要環節之一，血液檢測的質量是否得到保證，標本質量是關鍵，標本留樣差錯、標本不足量、標本抗凝不好、標本溶血等現象均可以直接影響血液檢測的質量，采供血機構實行血液集中化檢測， 是優化血站資源配置、保證輸血安全的必然措施， 也是血站發展的必然趨勢。集中檢測質量更是影響到多個地區血液安全，評估血樣質量是血液檢測的首要任務之一，我們通過對不同情況下評估影響血液樣本質量的因素，現報道如下：
1材料與方法
1.1對抗凝血樣與非抗凝血樣在試驗過程中加樣等環節對試驗的影響情況進行評估。
1.2使用不同材料的試管采集血液樣本，觀察血液樣本的溶血情況。
1.3統計一段時間血樣采集情況，發現有多個組次存在血樣不足量的現象，通過干預交流，連續追蹤一段時間觀察留樣效果。
1.4使用相同材料的試管采集血樣，考察不同距離運輸過程對血液樣本溶血情況的評估。
2結果
2.1對抗凝血樣在試驗加樣過程纖維蛋白堵針情況與非抗凝血樣在試，見表1。
2.2分別采用塑料材料的試管和玻璃材料的試管采集血樣，觀察其溶血情況，并進行統計分析，發現兩者差異有統計學意義，見表2。
2.3血樣接收過程發現存在不足量現象，回顧統計210個組次，發現6個組次存在留樣不足情況 ；對存在問題與相關部門協商并進行干預后，追蹤統計550組次，僅發生1個組次留樣不足情況，兩者比較差異有統計學意義。見表3。
2.4使用相同塑料材料采集血樣，1h內運輸并當天及時離心，與2h以上運輸并隔夜離心，觀察血液溶血情況，兩者差異有統計學意義。見表4。
3討論
血液樣本留樣是血液試驗室檢測工作的第一步，標本的采集與留樣環節是整個血液檢測工作的關鍵點，血液樣本的質量對檢驗的最終結果有著至關重要的影響。血液標本留樣目前使用標準化的真空采樣管，容器加塞全密閉，減少工作人員的職業暴露，提供生物安全性 ；真空管嚴密性＼潔凈度高，避免血樣污染情況發生，高速離心過程避免氣溶膠對試驗室的污染，也更方便遠距離血樣運輸。標準采樣管由廠家批量生產，抗凝劑質量得到保證。血標本的采集和前處理直接影響檢驗數據的準確性和可靠性[1]。表1顯示，非抗凝血樣離心后，有時纖維蛋白析出容易在檢測加樣過程發生堵針現象，對非抗凝血樣堵針現象進行統計分析，與同期使用抗凝血樣進行比較，堵針率差異有統計學意義。溶血的標本，紅細胞的破壞引起紅細胞內酶類物質非特異性反應，造成假陽性結果[1]。采用不同材料的抗凝真空管，內容物一致的情況下，玻璃材料的留樣真空管基本少見溶血現象，而塑料材料留樣真空管發生溶血概率較大，統計不同材料采樣真空管留樣情況，玻璃試管352管發生溶血現象2管。塑料試管526管發生溶血現象26管，兩者比較差異有統計學意義。采用相同的塑料真空管，采集血樣后1h內運輸當天離心發生溶血率基本在5%以內，而運輸距離超過2h以上且第2d離心，發生溶血率高達20%以上，兩者差異有統計學意義。
建議：最好使用玻璃資料的真空留樣管采集血液樣本，可以有效地避免溶血現象的發生，如果使用塑料真空留樣管，最好段距離采集血液后及時運輸并當天及時離心可以避免更多的溶血現象發生從而保證血液檢測的質量。微板速率法檢測ALT對乳糜、溶血等標本檢測存在一些困難[2]。有報道[3，4]：全自動生化分析儀可以通過設置自動稀釋或者濃縮程序進行標本的重新檢測，檢測結果可以自動覆蓋初次檢測結果，極大的提高了檢測速率和準確率。同血樣樣本除了溶血、纖維蛋白、凝塊析出等影響檢測效果的因素外，還有留樣不足現象也是直接影響集中化檢測報告發放的及時性，對采集護士進行相關采集知識的培訓干預及相關部門加強巡查管理工作前后，發生留樣不足量現象有明顯改變，干預前統計216組次發現6組次存在留樣不足，干預后連續追蹤550組次才發現1組次留洋不足情況，兩者比較差異有統計學意義，說明血樣采集與保留，除了材料因素、運輸過程以及操作技術等因素影響，操作者責任性、操作核對等過程也是影響血樣采集質量的重要因素。集中檢測各過程加強管理是保證血液質量的關鍵，尤其是血液標本的管理，血液標本從采集到實驗室檢測，運輸過程是一個保持"冷鏈"的過程。參與集中檢測單位間應該制定統一的標本采集和運送程序，從而保證標本采集、運輸的及時性和規范性。按相關規定進行安全、正確的包裝[5]，避免標本運輸過程激烈震動，防止溶血和外濺，確保標本質量。
參考文獻：
[1]齊寶洪，陳洪章，王娜等.采供血中心集中化檢測關鍵環節的控制[J].醫藥雜志，2007，28（1）：44-45.
[2]郝秀芳， 張奕琴. 集中化檢測模式下ALT 測定的探討[J]. 現代醫藥衛生，2008，24（3）：415-416.
[3]徐長根， 朱陽泉.采供血機構ALT的自動生化分析儀測定[J].中國輸血雜志， 2006， 19（ 4） ： 300.
【摘要】 目的對亞洲帶絳蟲膜聯蛋白B2(Annexins B2)進行克隆表達及免疫學初步研究。方法利用在線生物信息學工具從亞洲帶絳蟲成蟲cDNA文庫中篩選出Annexins B2基因，并將該基因克隆到原核表達質粒pET-28a(+)中，在大腸埃希菌BL21/DE3中誘導表達，表達產物通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定，重組后的蛋白用His-鎳蛋白純化柱純化，純化的重組蛋白用Western blotting進行免疫學分析。結果PCR、雙酶切及重組質粒DNA測序均顯示重組體構建成功，并得到高純度的蛋白，且該重組蛋白可被亞洲帶絳蟲、豬帶絳蟲及牛帶絳蟲患者的血清識別。結論亞洲帶絳蟲成蟲Annexins B2基因可在原核表達系統中獲得具有免疫活性的高效表達。
【關鍵詞】 亞洲帶絳蟲;膜聯蛋白B2;基因克隆;免疫反應性
ABSTRACT: ObjectiveTo clone and express the gene named as Annexins B2 of Taenia saginata asitica so as to analyze the immunogenicity of its recombinant protein.MethodsBy online analysis of the gene at bioinfomatics websites to identify the gene from the Taenia saginata asiatica full-length cDNA plasmid library， the gene was cloned into prokaryotic expression vector pET-28a(+) and then transformed to E.coli BL21 with IPTG induction. Thereafter， the gene product was analyzed by SDS-PAGE and purified by Ni-NTA affinity chromatography. In addition， the immunoreactivity of the purified recombinant proteins was analyzed by Western blotting.ResultsAs demonstrated by PCR， double enzyme digestion and DNA sequencing indicated that the recombinant plasmid was successfully constructed and highly expressed. The recombinant protein tested with Western blotting analysis could react with Taenia asiatica and Taeniarhynchus saginatus infected patient serum.ConclusionThe Annexins B2 of Taenia saginata asitica has been cloned and expressed in the prokaryotic expression system and the purified protein has been confirmed with immunogenicity.
KEY WORDS: Taenia saginata asiatica; Annexins B2; gene cloning; immunoreactivity
鑒于亞洲帶絳蟲與豬帶絳蟲及牛帶絳蟲在起源、分類學地位存在的差異[1-2]，本課題組率先構建亞洲帶絳蟲成蟲全長cDNA質粒文庫，并對該蟲進行功能基因組的研究工作[3]。本文利用生物信息學工具從文庫中篩選到了一個膜聯蛋白B2(Annexins B2)的同源基因，構建了原核表達載體，并對其原核表達產物進行免疫學方面的初步研究。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1血清、載體與菌株3種人體帶絳蟲患者血清取自糞檢陽性的帶絳蟲患者。原核表達質粒pET-28a(+)及大腸埃希菌BL-21/DE3由中山大學熱帶病防治教育部重點實驗室惠贈。
1.1.2主要試劑和工具酶Ex Taq酶(含dNTP)，BamHⅠ，XhoⅠ，T4 DNA連接酶 (大連寶生物工程公司);異丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)(美國Promega公司);質粒純化試劑盒(廣州東盛科技公司);辣根過氧化物酶標記的山羊抗豬IgG二抗、兔抗人二抗、3，3二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);氯化鈣、氯化鈉等為國產分析純試劑。
1.2方法
1.2.1Annexins B2基因的識別及擴增將獲得的亞洲帶絳蟲Annexins B2基因進行BLASTX分析。并根據已獲得的該基因全長編碼序列的開放閱讀框，利用軟件設計引物(引物由上海聯合基因公司合成)，分別帶上BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位點進行PCR反應。
1.2.2重組原核表達質粒的構建及鑒定PCR產物和pET-28a(+)載體分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收、連接后轉入大腸埃希菌BL-21/DE3感受態細胞，對陽性克隆依次進行質粒的提取、雙酶切和PCR鑒定，并進行重組質粒DNA測序鑒定(測序由英俊科技股份有限公司完成)。
1.2.3重組蛋白的表達及純化按照常規方法進行蛋白誘導表達，考馬斯亮蘭蛋白染色液染色觀察蛋白表達情況。確定蛋白表達后，進行大量的誘導表達，并判斷重組蛋白的可溶性，再將樣品加入預先處理好的Ni-IDA His.Bind樹脂親和層析純化柱中，最后再用PBS 24h透析以去掉過柱時留下的咪唑。
1.2.4Western blotting分析重組蛋白的免疫反應性用3種人體帶絳蟲患者及正常人血清與辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗人IgG進行Western blotting鑒定。
2結果
2.1Annexins B2基因的識別和序列分析該基因全長922bp，編碼區為224～686bp。其最大ORF為其完整編碼區。
2.2原核重組質粒的鑒定將重組質粒進行PCR和雙酶切鑒定，產物行0.8g/L瓊脂糖凝膠電泳。結果顯示在500bp左右有一清晰條帶，與目的基因大小基本相符。此外，重組質粒的測序報告表明插入序列與理論序列一致，證明重組質粒構建成功(圖1)。
2.2蛋白表達及純化結果將構建好的重組質粒轉化到E.coli BL/DE3中，超聲裂解后SDS-PAGE電泳分析結果顯示在大約25ku處出現高效表達條帶(圖2)，與目的蛋白基本相符。測得純化產物的蛋白濃度為0.526g/L。
2.3Western blotting鑒定純化蛋白的免疫反應性
用感染亞洲帶絳蟲、豬帶絳蟲、感染牛帶絳蟲的患者血清以及亞洲帶絳蟲感染豬的血清與純化蛋白反應的結果均顯示出較清晰的條帶，而陰性對照血清在相應位置未識別出該蛋白條帶(圖3)，表明該表達產物具有良好的免疫反應性。圖1重組質粒的PCR和雙酶切鑒定
Fig.1 The identification of the pET-28a(+)-Ta Annexins B2 by PCR amplification and digestion with restriction enzymesM1：DNA標準(DL2000);1：PCR產物;2：pET-28a(+)質粒雙酶切;3：pET-28a(+)-Annexins B2重組質粒雙酶切;M2：DNA標準(DL 15000)。圖2100g/L SDS-PAGE分析pET-28a(+)-Ta Annexins B2在大腸埃希菌中的表達產物及其純化產物Fig.2 100g/L SDS-PAGE analysis of the prokaryotic expression product and purified product
M：蛋白Marker;1：pET-28a(+)IPTG未誘導;2：pET-28a(+)IPTG誘導;3：pET-28a(+)-Annexins B2 IPTG未誘導;4：pET-28a(+)-Annexins B2 IPTG誘導;5：pET-28a(+)-Annexins B2上清;6：pET-28a(+)-Annexins B2沉淀;7：pET-28a(+)-Annexins B2純化蛋白。
3討論
帶絳蟲病的流行在我國西部一直是一個嚴重的公共衛生問題。每年由帶絳蟲病造成的健康和畜牧業經濟損失上百億，嚴重影響西部欠發達地區的社會發展。目前，亞洲帶絳蟲病的防治研究的重點集中在診斷和疫苗候選抗原、藥物靶標、致病的分子機制研究。圖3重組蛋白的Western blotting 鑒定Fig.3 Western blotting analysis of the recombinantsM：蛋白Marker;1：純化蛋白與亞洲帶絳蟲患者血清的反應結果;2：純化蛋白與牛帶絳蟲患者血清的反應結果;3：純化蛋白與豬帶患者血清的反應結果;4：純化蛋白與亞洲帶絳蟲感染豬血清的反應結果;5：純化蛋白與正常人血清的反應結果。
本實驗通過生物信息學方法從已經構建好的亞洲帶絳蟲成蟲cDNA質粒文庫中篩選出了一個膜聯蛋白(Annexins B2)的同源基因，并且預測出該基因位于胞漿，無跨膜區，二級結構基本上是以α螺旋為主。這些都符合膜聯蛋白家族的共同特征[4]。根據膜聯蛋白家族分布廣泛，表達豐富且穩定的特性，可以推測其在絳蟲的生理活動中可能起著重要的作用。
膜聯蛋白是一個廣泛存在的蛋白家族，在所有真核基因組中廣泛表達。具有內部重復單位和“G-X-G-T-(38residues)-D/E”基序[5]，即Ca2+結合區域的特征，用以結合帶有負電的脂質。雖然它為鈣結合蛋白，但是在結構上卻沒有EF手，而且在和Ca2+結合后，還可以與磷脂再次結合而發揮生物學效應。例如，細胞的胞吞胞吐，離子通道的形成，調節磷脂酶A2的活性及細胞內外Ca2+濃度、抗炎癥反應等。在長期的生物進化過程中，膜聯蛋白家族各成員在生物學特性和生理功能方面表現出非常復雜的關系，且在研究過程中發現，annexins沒有信號肽，沒有跨膜結構，是一個典型的細胞內蛋白。但是，卻有學者發現它可以與細胞外基質發生作用。例如，抗炎[6]、抗凝[7]、抑制腫瘤[8]等。最新的研究報道，當將其作為疫苗的候選因子時，可以消除一些寄生于哺乳動物體內的寄生蟲。此外，學者們認為膜聯蛋白是維持細胞膜表面結構和信號轉導功能的重要蛋白。并可能具有激活纖維蛋白酶原的功能，有助于破壞宿主的結締組織，使蟲體抗原更加容易進入宿主機體，誘發免疫應答。因此，對該基因的研究有助于進一步了解它的生物學功能及開辟預防治療寄生蟲病的新途徑[9-10]。
目前，Annexins B2已經在豬囊尾蚴的研究被發現并命名，但是具體的生理功能還不清楚，且在亞洲帶絳蟲研究領域還是空白。因此，本研究將亞洲帶絳蟲成蟲annexins克隆到原核表達質粒pET-28a(+)中，構建重組質粒，在大腸埃希菌BL-21/DE3中用IPTG誘導表達，表達產物通過SDS-PAGE電泳進行鑒定。SDS-PAGE結果表明，該蛋白在全菌和沉淀中都有表達，上清中有微量的表達，說明annexins主要表達在包涵體中。因此，進一步溶解包涵體[11]，經變性處理并親和層析純化后，得到了大量較純的重組蛋白。此外，還嘗試性的用上清過柱純化并用蔗糖進行蛋白濃縮，也得到部分有活性的蛋白。Western blotting就是以抗體-抗原沉淀反應為基礎的，可用于不同抗原的比較和定量。其檢測結果表明所獲得的重組蛋白與豬帶絳蟲、牛帶絳蟲及亞洲帶絳蟲有較強的交叉反應且在絳蟲中的診斷特異性不高，推測其不能作為免疫診斷抗原的合適候選分子。但是，其具有免疫活性的高效表達。由此可推測它是一個具有開發潛力的基因。總之，本項研究填補了該蛋白在亞洲帶絳蟲研究領域的空白，也為進一步研究該基因的生物學功能及在診斷尤其是疫苗研究方面奠定了基礎。
參考文獻
\[1\]包懷恩. 我國亞洲帶絳蟲研究的現狀和展望 \[J\]. 熱帶醫學雜志， 2002， 2(3):215-219.
\[2\]張朝云，楊明，張科，等. 云貴州三地牛帶絳蟲核糖體tRNA-ITS1序列分析 \[J\].貴陽醫學院學報， 2006， 31(4):291-295.
\[3\]黃江，胡旭初，包懷恩，等. 亞洲帶絳蟲成蟲全長cDNA質粒文庫的構建及EST測序 \[J\]. 熱帶醫學雜志， 2007， 7(2):116-118.
\[4\]MOSS SE， MORGAN RO. The annexins \[J\]. Genome Biol， 2004， 5:219-221.
\[5\]CHOI SH， KWON SR， LEE EH， et al. Molecular cloning， functional characterization and localization of an annexin from a fish gill fluke microcotyle sebastis (Platyhelminthes: Monogenea) \[J\]. Mol & Bioche Parasitol， 2009，163(1):48-53.
\[6\]高奮堂，曹云山，徐義先，等. 氟伐他汀對人外周血單個核細胞膜聯蛋白A1表達水平的影響 \[J\]. 臨床心血管病雜志， 2006， 22(4):209-211.
\[7\]王義會，閆強，王平，等. 膜聯蛋白B2基因的克隆及其真核表達載體的構建 \[J\]. 動物醫學進展， 2007， 28(3):31-33.
\[8\]朱逢佳，曾蘇，曹江. 膜聯蛋白-1與腫瘤\[J\]. 細胞生物學雜志， 2008， 30(5):581-585.
\[9\]ZHANG Y， WANG KH， GUO YJ， et al. Annexin B1 from Taenia solium metacestodes is a newly characterized member of the annexin family \[J\]. Biol Chem， 2007， 388(6):601-610.
[關鍵詞] 國際標準化比值；口服抗凝藥；華法林；準確性
[中圖分類號] R446.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2013）05（b）-0114-03
實驗室的全面質量控制（total quality control）指的是醫學臨床試驗的過程中影響試驗準確性的因素，包括試驗前質量控制、試驗中質量控制、試驗后質量控制[1-2]。本文主要探討口服抗凝劑（oral anticoagulants）華法林（warfarin）監測試驗—凝血酶原時間（prothrombin time，PT）的國際標準化比值（international normalized ratio，INR）試驗前及試驗中質量控制，以了解影響國際標準化比值準確性的因素。
隨著人們生活水平和醫療水平的提高，東北地區心腦血管病患者呈逐年增加的趨勢，為了防止缺血性腦梗死和心臟瓣膜置換術以及冠心病合并房顫等患者出院后血栓的形成，患者均需口服華法林抗凝治療[3]。由于華法林治療劑量與中毒劑量十分接近，會出現出血的并發癥，所以這樣的患者要監測凝血酶原時間的國際標準化比值（INR）。INR=（患者PT值/正常人平均PT值）ISI。ISI指國際敏感指數（international sensitivity index，ISI），ISI值越接近1，試劑對有關凝血因子降低的敏感度越高。由于患者不同生理狀態、飲食、服用藥物、合并疾病對口服華法林的影響[4]以及就診醫院所使用的儀器、試劑、操作方法的不同，同一患者不同時間或不同地點所測得的凝血酶原時間的國際標準化比值（INR）有所差異。因此，探討影響凝血酶原時間的國際標準化比值準確性的因素十分必要。
本文主要從患者飲酒、合并疾病及合并使用藥物及不合格標本的使用等方面對試驗前和試驗中的影響因素作一些探討，用以提高檢驗工作的質量。
1 資料與方法
1.1 一般資料
從2011年10月～2012年12月在本院住院或門診就診的62例患者，其中，心肌梗死患者預防血栓者16例，心臟瓣膜置換術后預防血栓者8例，冠心病合并房顫者9例，腦梗死預防血栓者15例，肺栓塞6例，靜脈血栓患者8例。年齡45～65歲，平均年齡56歲。其中，男性37例，女性25例。平均每個患者不同時間檢測7～9次PT和INR。其中27例口服華法林同時服用頭孢類抗生素，6例患者患有長期腹瀉，8例患者長期飲酒。
1.2 標本采集
清晨空腹采取靜脈血，放于109 mmol/L枸櫞酸鈉抗凝管中，試劑與血液比例為1∶9，顛倒混勻4次。3000 r/s離心15 min，30 min內分離，2 h內完成對INR的測定。
1.3 儀器與試劑
儀器為Sysmex CA1500全自動血凝儀，試劑由SIEMENS公司提供，凝血酶原時間試劑，批號是：LOT545369，ISI值為1.0。
1.4 比對實驗
上述27例上感患者停用頭孢類類抗生素后重測，6例腹瀉治療后重測，8例飲酒者戒酒后重測，合計82例；標本量不準（過少）、溶血標本、脂血標本、標本放置時間過久者重新采集符合要求的標本重測合計92例。
1.5統計學分析
采用SPSS 13.0統計軟件包進行統計學分析，計量數據以均值±標準差（x±s）表示，不合格標本與重測標本之間均數比較用獨立樣本t檢驗分析，以P < 0.05為差異有統計學意義，P < 0.01為差異有高度統計學意義。
2 結果
2.1 采血前患者狀態對INR的影響
選取停用頭孢類抗生素前后、腹瀉治療前后、戒酒前后INR值對比，見表1。1、2組INR對比，P值均為0.000，兩組結果差異有高度統計學意義（P < 0.01）；3、4組INR對比，P < 0.05，兩組差異有統計學意義；5、6組INR對比，P < 0.01，兩組差異有高度統計學意義。可見口服頭孢類抗生素，腹瀉及飲酒對INR值有影響。
2.2 采血后不合格標本及測定時間對INR的影響
標本溶血、標本量不足、未及時測定及這類標本重采后重測結果對比，見表2。1、2組INR對比P < 0.05，兩組差異有統計學意義；3、4組INR對比，P < 0.05，兩組差異有統計學意義；5、6組INR對比，P < 0.01，差異有高度統計學意義。可見標本溶血，采集的標本量不足及標本放置過久未及時測定對INR值有影響。
3 討論
3.1 采血前的因素對的凝血酶原時間的國際標準化比值的影響機制
采血前的因素對的凝血酶原時間的國際標準化比值的影響機制主要取決于這些因素對華法林藥效的影響[5]。華法林是香豆素類藥物的一種，是維生素K拮抗劑，它通過競爭性抑制維生素K環氧化物還原酶起作用，使還原型維生素K不能合成。還原型維生素K的缺乏導致體內凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ不能正常羧化，致使血液不能凝固[6]。有如下因素影響口服華法林的藥效，進而影響凝血酶原時間（PT）及國際標準化比值（INR）。如患者的身高、體重、年齡的不同，導致華法林在體內代謝的程度不同，比如體重大的人所需華法林劑量增大，高年齡的人華法林肝代謝率下降，所需華法林的劑量減少，如果仍使用標準劑量可導致出血。此外飲食、吸煙、飲酒、合并用藥（尤其影響肝藥酶代謝能力的藥物）對華法林最佳穩定劑量產生不同程度的影響[7]。飲食中提供維生素K的食物（如芹菜、韭菜、海藻、花椰菜等）會降低華法林的作用；飲酒及同期有肝功能不足會增加華法林的作用；當合并服用藥物如氯吡格雷、辛伐他汀、優甲樂、苯溴馬隆、尼麥角林、西咪替丁、紅霉素、頭孢菌素，大劑量的青霉素，中藥如當歸、銀杏葉、連翹、丹參可影響華法林的藥效。當合并甲亢、甲減、腎功能不全、腹瀉時需嚴密監測患者的臨床癥狀和INR。嚴重的腹瀉可導致維生素K吸收不足，從而增加華法林的藥效。
本試驗選取口服頭孢類抗生素、腹瀉患者、長期飲酒的溶栓適應癥患者，采集他們口服藥物前后、腹瀉治療前后及戒酒前后標本，測定凝血酶原時間及國際標準化比值進行對比，表明這類因素對INR是有影響的。其中頭孢類抗生素可直接降低維生素K依賴性凝血因子（Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ）的合成，而這些凝血因子參與內外源性凝血機制，使反應外源性凝血的PT延長，并使INR增高。其中腹瀉的患者，一方面食物中維生素K無法正常吸收，另一方面腸道細菌（如大腸桿菌）無法合成維生素K，可導致體內的維生素含量減少，使華法林的藥效增加，增加凝血酶原時間。其中長期飲酒的患者，引起肝功能不足，會增加華法林的作用，使凝血酶原時間和國際標準化比值增加。
3.2 溶血標本、標本量不足、未及時測定等對的凝血酶原時間的國際標準化比值的影響機制
標本采集不順利、注入真空采血管中的血標本劇烈震蕩或離心速度過大、時間過長都可造成標本溶血，標本溶血造成INR的降低[8]。其中標本量不足，造成抗凝劑與血液比例大于1∶9，相當于抗凝劑用量過大，造成PT和INR增高。而標本在室溫放置時間過久，可導致凝血因子Ⅷ和Ⅴ對熱不穩定，使凝血因子活性逐漸降低，使INR增高。
綜上所述，影響凝血酶原時間的國際標準化比值測定結果的因素很多，無論是試驗前還是試驗中都要執行嚴格的質量控制，以保證檢驗結果的準確性，最大程度的為臨床溶栓治療提供合理依據。
[參考文獻]
[1] 張立中，陳洪山，趙敏，等. 凝血標本采集與處理過程中質量控制[J]. 檢驗醫學與臨床，2007，4（4）：342-343.
[2] 王鴻利，王學峰. 血栓病臨床新技術血栓與止血檢驗的標準化與質量控制[M]. 北京：人民軍醫出版社，2003：231-235.
[3] Bach AU，Anderson SA，Foley AL，et al. Assessment of vitamin K status in human subjects administered ”minidose” warfarin[J]. Am Clin Nutr，1996，64（6）：894-902.
[4] Siguret V，Pautas E，Gouin-Thibault I. Warfarin therapy：influence of pharmacogenetic and environmental factors on the anticoagulant response to warfarin[J]. Vitamins and Hormones，2008，78：247-64.
[5] Go AS，Hylek EM，Chang Y，et al. Anticoagulation therapy for stroke prevention in atrial fibrillation： how well do randomized trials translate into clinical practice[J] . JAMA，2003，290（20）：2685-2692.
[6] D'Andrea G， DˊAmbrosio RL，Margaglione MO. Ralanticoagulants pharmacogenetice relationship between genetic and nongenetic factors[J] . Blood Rev， 2008，22：127-40.
[7] 王秀明，吳紅麗，李志斌.標本因素對凝血四項檢測結果的影響2450例分析[J]. 中國誤診學雜志，2008，8（21）：5181-5182.
【摘要】 目的 觀察蟲草素對腫瘤壞死因子α(TNFα)刺激的離體大鼠血管平滑肌細胞(VSMCs)增殖和syndecan4蛋白表達的影響。 方法 體外培養大鼠胸主動脈VSMCs，分別應用終濃度為20 ng/mL TNFα、20 μmol/mL蟲草素、40 μmol/mL蟲草素、20 ng/mL TNFα+20 μmol/mL蟲草素、20 ng/mL TNFα+40 μmol/mL蟲草素作用24 h，并設對照組進行比較。采用MTS/PMS法確定VSMCs的增殖狀態，利用Western blot蛋白免疫印跡法測定VSMCs中syndecan4蛋白的表達。結果 (1)與對照組比較，TNFα組能顯著刺激大鼠VSMCs的增殖(P0.05)。TNFα聯合蟲草素共同作用組與TNFα組比較， VSMCs增殖均顯著減少(P
【關鍵詞】 syndecan4;蟲草素;腫瘤壞死因子α;血管平滑肌細胞;細胞增殖
Abstract:Objective To investigate the effects of cordycepin on the proliferation of rat vascular smooth muscle cells(VSMCs)and expression of syndecan4 protein induced by tumor necrosis factorα(TNFα).Methods VSMCs were cultured in vitro and exposed to 20 ng/mL TNFα，20 μmol/mL cordycepin，40 μmol/mL cordycepin，20 μmol/mL cordycepin with 20 ng/mL TNFα，and 40 μmol/mL cordycepin with 20 ng/mL TNFα，respectively. All groups were treated for 24 h in vitro，in addition to the control group established for comparison. The ratio of proliferation of VSMCs was determined by nonradioactive MTS/PMS assay and the expression of syndecan4 protein was evaluated by Western blotting using antisyndecan4 antibody.Results (1) Compared to the control group，TNFα significantly stimulated the proliferation of rat VSMCs at the concentration of 20 ng/mL in TNFα group (P0.05)，but significantly inhibited VSMCs proliferation induced by TNFα (P
Key words:syndecan4; cordycepin; tumor necrosis factorα; vascular smooth muscle cells; cell proliferation
血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖和表型改變是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的主要病理基礎之一，動脈粥樣硬化是對血管損傷的過度炎癥反應。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factoralpha，TNFα)是炎癥反應的關鍵調節因子之一，可從多種不同的炎癥細胞中釋放，在動脈粥樣硬化發生發展中起著關鍵的作用。Syndecan4是硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)類的跨膜轉運蛋白多糖syndecans家族的成員之一。Syndecan4主要在血管平滑肌細胞上表達，它作為一種與生長因子結合的共受體(coreceptor)，調控著多種細胞生物學效應，在細胞的伸展、識別、黏附、遷移和增殖控制中扮演著重要的角色，同時也介導炎癥反應[1]。蟲草素(cordycepin)即3’脫氧腺苷，為含氮配糖體的核酸衍生物，為冬蟲夏草的主要藥理活性成分之一。研究表明蟲草素具有抗炎和免疫調節等作用[2]。本研究觀察了蟲草素對TNFα誘導的大鼠血管平滑肌細胞增殖及syndecan4蛋白表達的影響。
1 材料與方法
1.1 主要材料
6周齡雄性SPF級SD大鼠，由南方醫科大學實驗動物中心提供(合格證號：SCXK粵20060015);DMEM培養基、0.25%胰酶均購自美國Gibco公司;胎牛血清(FBS)購自美國Hyclone公司;一次性96孔板購自美國Corning公司;TNFα購于美國Peprotech公司;蟲草素購于美國Sigma公司(1108582002);CellTiter 96 Assay MTS/PMS試劑盒購于美國Promega公司(G5421);一抗為兔抗大鼠syndecan4多克隆抗體H140，購置于美國Santa Cruz公司(sc15350);二抗為羊抗兔IgG抗體，購置于英國Amersham公司(NA934);ECL化學發光試劑盒購于美國Pierce公司(JE120872);其余試劑均為國產分析純。
1.2 VSMCs的原代培養
參考王道生貼塊法[3]進行。取SD大鼠胸主動脈中膜，以貼塊法培養于含10%(φ)胎牛血清的DMEM 培養基中，置于37 ℃、5%的CO2孵箱中培養。2～3周出現致密細胞層后即可傳代，傳代細胞呈典型的“峰與谷”樣生長。細胞經使用抗αactin抗體鑒定為VSMCs，實驗所用的VSMCs均為第3～6代傳代細胞。
1.3 增殖評價
體外培養的SD大鼠VSMC在96孔板中以5 000個細胞/孔的密度鋪板;8 h后，換成含1%FBS的DMEM培養基，維持48 h以獲得同步的細胞生長停止;分別加入20 ng/mL TNFα、20 μmol/mL蟲草素、40 μmol/mL蟲草素、20 ng/mL TNFα+20 μmol/mL蟲草素、20 ng/mL TNFα+40 μmol/mL蟲草素。對照組為含5%FBS的DMEM培養基。24 h后細胞的增殖率通過應用96 Assay MTS/PMS試劑盒確定。用BioRad 550型Microplate Reader以490 nm波長測量吸光度(A)值，細胞的增殖率用A值表示。
1.4 Syndecan4蛋白免疫印跡測定
將體外培養的SD大鼠VSMCs分別用已配制好的試劑：20 ng/mL TNFα、20 μmol/mL蟲草素、40 μmol/mL蟲草素、20 ng/mL TNFα+20 μmol/mL蟲草素、20 ng/mL TNFα+40μmol/mL蟲草素刺激，對照組為5%FBS DMEM培養液。24 h后用DHanks液沖洗，冰上裂解細胞，收獲蛋白。取適量待檢測蛋白用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將已分離的條帶電轉移到PVDF膜上，4 ℃封閉過夜，加入配置好的一抗(1∶200稀釋)、二抗(1∶10 000稀釋)孵育，用ECL化學發光試劑盒檢測。βactin檢測作為內對照。實驗膠片用光密度掃描儀掃描，結果用圖像軟件BIORAD Quantity One分析。
1.5 統計學分析
各組A值用均數±標準差(±s)表示，用SPSS 16.0軟件進行數據錄入和統計分析。采用析因方差分析，兩樣本均數比較采用獨立樣本t檢驗;多組均數比較采用單向方差分析;組間多重比較，方差齊性采用LSD檢驗，方差不齊采用GamesHowell檢驗，P
2 結 果
2.1 蟲草素對TNFα誘導的大鼠VSMCs增殖的影響
MTS/PMS法測定各組細胞增殖率分別為：對照組0.666±0.098，TNFα 20 ng/mL組1.013±0.150，20 μmol/mL蟲草素組0.660±0.097，40 μmol/mL蟲草素組0.676±0.085，TNFα 20 ng/mL聯用20 μmol/mL蟲草素組0.662±0.107，TNFα 20 ng/mL聯用40 μmol/mL蟲草素組0.627±0.135。統計分析結果表明，與對照組比較，20 ng/mL TNFα組能明顯刺激大鼠VSMCs的增殖(P0.05)。20 μmol/mL蟲草素聯用20 ng/mL TNFα、40 μmol/mL蟲草素聯用20 ng/mL TNFα組與20 ng/mL TNFα組比較對VSMCs增殖均有明顯的抑制作用(P
以目的蛋白對照組灰度值與內參對照組灰度值的比值為1，其余各組syndecan4蛋白表達量分別為：TNFα 20 ng/mL組1.375±0.017，20 μmol/mL蟲草素組1.009±0.120，40 μmol/mL蟲草素組1.002±0.050，TNFα 20 ng/mL+20 μmol/mL蟲草素組0.962±0.057， TNFα 20 ng/mL+40 μmol/mL蟲草素0.914±0.057(如圖2) 。與對照組比較，TNFα組能明顯刺激VSMCs的syndecan4蛋白表達(P0.05)。TNFα聯合蟲草素共同作用組與TNFα組比較對VSMCs的syndecan4蛋白表達均有顯著抑制作用(P
3 討 論
炎癥反應貫穿于腦血管動脈粥樣硬化的起始、病變進展及斑塊破裂、血栓形成的全過程。TNFα是炎癥反應的關鍵調節因子之一，TNFα主要由巨噬細胞產生， [JP+1〗與正常細胞相比， 在動脈粥樣硬化病
Figure 3 Effects of cordycepin on syndecan4 protein expression in rat vascular smooth muscle cells induced by TNFα變中其表達上調，在動脈粥樣硬化斑塊局部的血管平滑肌細胞中發現有TNFα的mRNA表達。血管平滑肌細胞表面具有TNFα受體，是TNFα作用的靶細胞。TNFα與血管平滑肌細胞上的相應受體結合后可以促進細胞的有絲分裂過程。
研究表明，syndecan4在炎癥及組織創傷愈合中發揮著重要的作用[4]。Syndecan4主要在血管平滑肌細胞上表達，其表達在動脈損傷早期即可增加，隨后在7 d內減少到可控制的水平。在內皮組織裸露的動脈，血管中層平滑肌syndecan4的mRNA占整個血管壁的70%～90%。Rauch [5]等研究發現syndecan4是凝血酶誘導人VSMC遷移和增殖反應所必需的成分，凝血酶通過誘導sydnecan4蛋白的表達上調，從而激活p44/42 MAPK。Telci[6]等研究顯示，在組織損傷修復中，syndecan4可與纖維結合蛋白轉谷氨酰胺酶復合物結合，激活蛋白激酶Cα后，syndecan4聚集并與β1整合素結合，激活細胞存活機制及RGD依賴的細胞黏附，從而導致MAPK途徑激活及肌動蛋白應力纖維形成。Houston[7]等報告了氧化型亞油酸能夠刺激大鼠和人的VSMC增殖并上調syndecan4的表達。新近的研究提示，syndecan4作為一種重要的跨膜蛋白，是信號從細胞表面傳導到細胞內部的重要傳遞者，也是細胞外信號引起細胞增殖反應的重要遞呈者。位于細胞表面的syndecan4主要通過激活蛋白激酶Cα參與細胞的信號傳導。在細胞因子等致動脈粥樣硬化因素的刺激下，syndecan4通過硫酸乙酰肝素鏈與胞外的配體相結合，并調節其活性，經保守的跨膜區傳導進入胞內，在其胞質尾區發生一系列的去磷酸化作用及寡聚化作用，使syndecan4與PIP2的親和力增強，從而激活了蛋白激酶Cα，進一步激活了p44/42 MAPK，從而啟動了大多數促細胞增殖的共同途徑ERK途徑。至于TNFα是如何影響syndecan4蛋白的表達，Zhang[8]等的實驗證明了主要是通過兩種機制來實現:一種是通過NFκВ介導的方式來增加syndecan4的基因表達;另一種是延長syndecan4mRNA的半衰期。
冬蟲夏草是名貴中藥材，具有多種藥理作用，《本草從新》中記載：“保肺益腎，止血化痰，止勞嗽。” 冬蟲夏草味甘、性平，歸肺腎二經。主要功效為補腎陽、益腎精、補肺氣、祛痰止咳、平喘。蟲草素為冬蟲夏草的主要藥理活性成分之一，具有免疫調節作用、抗炎作用及抗腫瘤等作用。Zhou[9]等進行的體外實驗證實蟲草素能通過促進人外周單核細胞白介素10的分泌和白介素10 mRNA的表達來參與抗炎反應。De Jong [10]等發現蟲草素能通過誘導調節性T細胞增殖來影響炎癥反應。近年來發現，蟲草素對轉錄因子NFκВ的抑制作用是其發揮抗炎作用的重要機制。NFκВ是合成蛋白的重要轉錄因子。蟲草素抑制了NFκВ的從胞漿到核內易位和表達。在Kim [11]等的實驗中，為了明確蟲草素的抗炎機制，檢測了脂多糖激活的RAW264.7巨噬細胞中Akt和MAP激酶的活性，在劑量依賴模式中，蟲草素能顯著抑制巨噬細胞中Akt和p38MAPK激酶的磷酸化，從而抑制了NFκВ從胞漿到核內的易位;除了通過抑制上述兩種激酶而影響NFκВ外，蟲草素還可以抑制轉錄因子抑制劑IκB alpha 的磷酸化，延長其降解時間。蟲草素通過抑制NFκВ的作用，導致 iNOS和COX2基因表達下調，使NO產物的生成減少，最終的結果是抑制了炎癥反應。YoungRae Lee[12]等人也證明了蟲草素可以通過抑制NFκВ而完全限制了受紫外線激發的表皮成纖維細胞中MMP1和MMP3的表達。因此，可以推測蟲草素通過影響眾多細胞因子的表達而發揮抗炎作用，而它對NFκВ的抑制作用是其中關鍵的一環。本實驗提示一定劑量的蟲草素能夠顯著抑制TNFα誘導的VSMCs增殖和syndecan4蛋白表達。推測可能的機制是TNFα通過與VSMCs表面的相應TNF受體結合，使NFκВ的表達和易位增加，從而在基因水平使syndecan4蛋白的表達增加，隨后激活p44/42MAPK信號傳導通路，導致血管平滑肌細胞增殖，而蟲草素可能通過阻斷TNFα介導的NFκВ的易位和表達，從而使TNFα誘導的syndecan4蛋白的表達下降，減少蛋白激酶Cα的激活，從而進一步抑制p44/42MAPK的磷酸化，最終導致大鼠VSMCs增殖的減少。
綜上所述，本研究表明一定劑量的蟲草素能夠顯著抑制TNFα誘導的大鼠VSMC增殖和syndecan4蛋白表達。因此，有必要進一步研究蟲草素抑制syndecan4蛋白表達的相關潛在靶點。
參考文獻
[1] WANG L C，FUSTER M，SRIAMARAO P，et al. Endothelial heparan sulfate deficiency impairs Lselectinand chemokinemediated neutrophil trafficking during inflammatory responses[J]. Nature Immuno，2005，6(9):902-10.
[2] 王雅玲，王亮，金黎明. 蟲草素藥理學研究進展[J].時珍國醫國藥，2008，19(11)：2667-2668.
[3] 歐陽平，彭立勝，楊紅，等.重組人白介素-10抑制TNFα誘導的血管平滑肌細胞增殖[J].生理學報，2002，54(1):79-82.
[4] BARTLETT A H，HAYASHIDA K，PARK P W. Molecular and cellular mechanisms of syndecans in tissue injury and inflammation[J]. Mol Cells，2007，24(2):153-166.
[5] RAUCH B H，MILLETTE E，KENAGY R D，et al. Syndecan4 is required for thrombininduced migration and proliferation in human vascular smooth muscle cells[J]. Biol Chem，2005，280(17):17507-17511.
[6] TELCI D，WANG Z，LI X，et al. FibronectinTG2 matrix rescues RGDimpaired cell adhesion through syndecan4 and beta 1 integrin cosignaling[J]. J Biol Chem，2008，283(30):20937-20947.
[7] HOUSTON M，JULIEN M A，PARTHASARATHY S，et al. Oxidized linoleic acid regulates expression and shedding of syndecan4[J].Am J Physiol Cell Physiol，2005，288(2):C458-466.
[8] ZHANG Y，PASPARAKIS M，KOLLIAS G，et al. Myocytedependent regulation of endothelial cell syndecan4 expression. Role of TNFalpha[J]. Biol Chem，1999，274(21):14786-14790.
[9] ZHOU X X，MEYER C U，SCHMIDTKE P，et al.Effect of cordycepin on interleukin10 production of human peripheral blood mononuclear cells [J]. Eur J Pharmacol， 2002，453(2-3):309-317.
[10] DE JONG E C，SMITS H H，VAN CAPEL T M M，et al.Cordycepin or cholera toxin B prime for mature dendritic cells that drive the development of regulatory T cells [D]. Bruggle:8th International Symposium on Dendritic Cells，2004.
【摘要】 【目的】 觀察當歸補血湯含藥血清對氧化低密度脂蛋白(OxLDL)激活小鼠單核細胞系RAW2647細胞中核轉錄因子κBp65(NFκBp65)mRNA表達的影響。【方法】將新西蘭兔8只隨機分為空白血清組和含藥血清組，每組各4只，分別灌胃生理鹽水和當歸補血湯水煎液(劑量為84 g·kg-1·d-1)，分離血清。將RAW2647細胞懸液接種于培養瓶中，培養24 h，分為空白對照組、OxLDL組、PAR組(終濃度為10 μmol/L的小菊白內酯)、體積分數10%的含藥血清組。除空白對照組外，其他各組分別加入100 μg/mL OxLDL刺激4 h，收集細胞。采用實時熒光定量PCR法檢測各組細胞NFκBp65 mRNA的表達量。【結果】 OxLDL組與空白對照組比較，NFκBp65 mRNA的表達量增加(P< 005);含藥血清組與OxLDL組比較，NFκBp65 mRNA的表達量減少(P< 005)。【結論】 當歸補血湯含藥血清能下調NFκBp65 mRNA的表達量，抑制、阻斷NFκBp65的表達可能是當歸補血湯抗動脈粥樣硬化的作用機制之一。
【關鍵詞】 當歸補血湯/藥理學;動脈粥樣硬化/中藥療法;信號轉導;基因表達調控;細胞培養
動脈粥樣硬化(atherosclerosis， AS)是導致心腦血管疾病發生的重要病理改變，而氧化低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipoprotein， OxLDL)對AS的發生發展起著非常重要的作用。在動脈內膜下，低密度脂蛋白經氧化修飾成OxLDL，后者可以抑制低密度脂蛋白與其受體結合，抑制巨噬細胞的移動，致使局部OxLDL大量堆積，形成泡沫細胞，從而加速As的形成[1]。Brand等[2]發現AS病灶粥樣硬化斑塊內膜和中膜的平滑肌細胞及巨噬細胞、內皮細胞里均有活化的核轉錄因子κB(nuclear factorkappa B，NFκB)。NFκB可能是啟動AS的關鍵因子[3]，由血管壁LDL的修飾到引發炎癥和趨化因子的釋放、內皮細胞黏附分子的表達等程序導致單核細胞向待損害部位聚集，NFκB都參與了其中[4-6]。當歸補血湯目前已被廣泛應用于AS及其相關疾病的治療，療效確切，具有降低血脂和抗氧化損傷的效應，能夠明顯減輕由OxLDL引起的單核細胞的趨化作用[7-9]。為探討該方抗AS的作用機理，本研究觀察了其含藥血清對OxLDL激活小鼠單核細胞系RAW2647細胞中NFκBp65 mRNA表達的影響。現報道如下。
1材料與方法
11主要儀器及試劑BNA3210型CO2培養箱(日本ESPEC公司)，SWCJ1FD型超凈工作臺(中國蘇州凈化設備公司)，AXIOVERT 200倒置顯微鏡(日本ZEISS公司)，ABI3900臺式高通量DNA合成儀(美國ABI公司)，ABI7300熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，Sigma3k18型高速低溫離心機(美國Sigma公司)，小菊白內酯(Parthenolide，PAR;美國Santa cruz 公司，批號：sc3523)，RPMI1640培養基(美國Invitrogen公司，批號：12491015)，胎牛血清(美國Invitrogen公司，批號：10099158)，逆轉錄試劑盒(中晶公司，批號：K1621)，總RNA提取試劑(Trizol Reagent，美國Invitrogen公司，批號：15596026)。
12實驗動物健康新西蘭大耳白兔共8只，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(粵)20030001，雌雄各半，3～4月齡，體質量15～20 kg。
13當歸補血湯水煎液的制備黃芪、當歸均使用道地藥材，為甘肅產品，購自廣東省藥材公司并加以鑒定。按照《內外傷辨惑論》原方中黃芪和當歸以質量比5∶1的配伍比例稱取生藥，以每g生藥加水6 mL，冷水浸泡30 min，煮沸后再文火慢煎40 min，趁熱過濾，濾液自然滴盡，第2煎按每g生藥加水4 mL，煎法同前，合并濾液，95 ℃水浴濃縮成含生藥084 g/mL的水煎液，4℃保存。
14血清制備8只兔隨機分為空白血清組和含藥血清組，每組4只，分別灌胃生理鹽水和當歸補血湯水煎液，實際灌胃劑量按動物體表面積換算得出，臨床等效劑量為168 g/kg，按每kg體質量每天灌胃量為5倍臨床等效劑量即84 g·kg1·d1，連續灌胃3 d，第4天上午于禁食12 h后灌胃1次，1 h后乙醚麻醉動物，無菌條件下心臟采血，將抽取的血液室溫下靜置3 h，離心，取上清，56 ℃水浴中滅活，022 μm微孔濾器過濾除菌，-70 ℃保存備用。
15細胞培養將RAW2647細胞培養于含體積分數10%胎牛血清的RPMI1640培養液中，置于37 ℃ 、體積分數5% 的CO2培養箱中培養，2 d換液1次。細胞長滿單層后可傳代，用25 g/L的胰酶乙二胺四乙酸消化處于生長旺盛期的單層培養細胞，再用含體積分數10%胎牛血清的RPMI1640培養基終止消化，1 000 r/min離心5 min，收集細胞，制成細胞懸液，細胞計數，調整細胞密度為3×104 /cm2，再培養。
16實時熒光定量PCR法檢測RAW2647細胞中NFκBp65 mRNA的表達量從Gen Bank上查找和對比目的基因，設計引物：Mouse GAPDH：上游引物5AACAGGGTGGTGGACCTCAT3;下游引物5GGGATAGGGCCTCTCTTGCT3。Mouse NFκBp65：上游引物5ACGCGGATTCCTGTACACCT3;下游引物5CAGGAGCTCCACAGGACAGA3。合成引物。
17實驗分組及處理實驗分為空白對照組、OxLDL組、PAR組、含藥血清組。調整細胞懸液密度5×104/cm2，按分組接種于24孔板中，每組4個復孔。在37℃ 、體積分數5% CO2飽和濕度下培養24 h。棄去原培養液，以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2～3次。空白對照組、OxLDL組加含體積分數10%空白血清的RPMI1640培養液孵育24 h;PAR組加含體積分數10%空白血清的RPMI1640培養液孵育24 h，再加入終濃度為10 μmol/L PAR預處理2 h;含藥血清組加含體積分數10%含藥血清的RPMI1640培養液孵育24 h。除空白對照組外，其他各組分別加入100 μg/mL OxLDL刺激4 h。抽提RNA：棄原培養液，不洗，每孔各加500 μL 總RNA提取試劑，吸打混勻。室溫靜置5 min。加100 μL氯仿，劇烈震蕩15 s。室溫靜置5 min。4℃、12 000 r/min離心15 min，此時溶液分為3層，取上清液，移至新離心管中，加250 μL異丙醇，混勻，室溫靜置10 min。4℃、12 000 r/min離心8 min。棄上清，加入500 μL 體積分數75%乙醇洗沉淀，4℃、12 000 r/min離心5 min，風干5 min。焦碳酸二乙酯(DEPC)溶解沉淀，-70℃保存。逆轉錄反應：加RNA樣品11 μL，六聚物引物1 μL入PCR小管，吸打混勻。放入PCR儀中，70℃、5 min。取出加入5倍反應緩沖液4 μL、RNA酶抑制劑1 μL、三磷酸脫氧核糖核苷(dNTP) 混合液 2 μL，吸打混勻。放入PCR儀中，25℃、5 min。取出加入逆轉錄酶1 μL，吸打混勻。放入PCR儀中，25℃、10 min，42℃、60 min，70℃、10 min。熒光定量PCR反應：準備96孔板，按上述分組，每組各4個復孔，25 μL反應體系，依次加入蒸餾水101 μL、熒光染料混合液125 μL、上游引物02 μL、下游引物02 μL、樣品溶液2 μL。吸打數次混勻，稍離心。放入PCR儀，95℃、15 s，60℃、60 s，進行40個循環。反應結束后，由電腦自動分析并根據標準曲線計算樣品及內參的基因拷貝數。
18統計學方法結果以鴨乙肝病毒為標準品，計算樣品目的 mRNA拷貝數與內參照三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH) mRNA拷貝數的比值進行統計分析。數據采用SPSS 130 軟件包進行統計分析。
2結果
RAW2647細胞NFκBp65 mRNA表達的變化：各組溶解曲線峰值較集中，未出現非特異性擴增(圖1-c、圖2-c，彩圖見第556頁)。各組內參照GAPDH cDNA擴增循環數較集中，提示各組樣品濃度較接近(圖2-b，彩圖見第556頁);各組NFκBp65 cDNA擴增循環數差距明顯(圖1-b，彩圖見第556頁)，提示各組NFκBp65 mRNA表達量有明顯差異。表1結果顯示：OxLDL組與空白對照組比較差異有顯著性意義(P
3討論
NFκB通路是一條重要的細胞內信號轉導通路，參與了多種生理病理過程的調節。其與AS的發生發展關系密切，已成為國內外學者進行抗AS研究所高度重視的一個藥理學作用靶點。OxLDL首先激活NFκB上游激酶，引起級聯反應，最終活化NFκB，使其轉入核內，引起相關基因的表達，啟動一系列炎癥因子的基因轉錄，而炎癥因子的過度表達又會加重NFκB的活化[10]。NFκB家族成員以不同組合形成異源二聚體，每一個NFκB蛋白均有特殊的作用，其中p65/p50異聚體在大多數哺乳動物細胞中大量存在，p65含有強轉錄激活結構域，與AS的發生發展關系密切[11]。因此，本實驗觀察了當歸補血湯含藥血清對OxLDL誘導的RAW2647細胞中p65 mRNA表達的影響，探討當歸補血湯是否通過NFκBp65起到抗AS作用。本實驗結果表明：OxLDL可明顯激活RAW2647細胞中的NFκB通路，當歸補血湯含藥血清能下調NFκBp65 mRNA表達。
綜上所述，在AS發生的早期脂質浸潤、泡沫細胞形成過程中，NFκB通路發揮著重要作用，當歸補血湯可能通過調節該通路以調控相關致炎因子的表達進而影響AS的發生發展，抑制、阻斷NFκB信號轉導通路可能是當歸補血湯抗AS損傷作用的機制之一。
參考文獻
[1]蔡海江.動脈粥樣硬化基礎與臨床 [M].南京: 江蘇科學技術出版社，1996：110.
[2]Brand K， Page S， Rogler G， et al. Activated transcription factor nuclear factorkappa B is present in the atherosclerotic lesion [J]. J Clin Invest， 1996，97: 1715.
[3]Libby P. Inflammation in atherosclerosis [J].Nature，2002，420：868.
[4] Burleigh M E， Babaev V R， Oates J A， et al. Cyclooxygenase2 promotes early atherosclerotic lesion formation in LDL receptordeficient mice[J]. Circulation，2002，105：1816.
[5]Gu L， Okada Y， Clinton S K，et al. Absence of monocyte chemoattractant protein1 reduces atherosclerosis in lowdensity lipoprotein receptordeficient mice [J]. Mol Cell，1998，2：275.
[6]Cybulsky M I， Iiyama K， Li H， et al. A major role for VCAM1， but not ICAM1， in early atherosclerosis [J]. J Clin Invest，2001，107：1255.
[7]陳淑冰，孟華民，胡文堯.當歸補血湯抗自由基作用的研究[J].中藥藥理與臨床，1995，1(1):68.
[8]陳淑冰，孟華民.當歸補血湯抗氧化作用的研究[J].四川省衛生管理干部學院學報，1995，14(2):3.
[9]黃水清，韓凌，王劍，等.當歸補血湯含藥血清抗動脈粥樣硬化的機理研究[J].廣州中醫藥大學學報，2004，21(4):304.
愉快的暑假到了，為了使自己的假期生活過的健康充實，歡樂而有意義，我特別為自己的暑假生活制定了具體的計劃。我的計劃大概分為兩個方面：學習計劃、生活計劃。
第一，學習計劃，具體如下：
1.爭取7月1日至7月20日完成語、數、外三門暑假作業。計劃大概每天完成6面暑假作業。
2.預習語文六年級上冊的古詩詞，文言文，日積月累等等。并有重點的選擇背誦。
3.預習六年級上冊數學相關內容。
4.預習六年級上冊英語的課程，默寫有關單詞，聽磁帶。
5.每天看課外書，報紙，還可以看看動畫片，但時間不能太長。
6.寫暑假日記一本，作文10篇，練好鋼筆字。
第二，生活計劃具體如下：
1.培養個人的生活能力，比如：做飯、洗衣服。幫父母干一些力所能及的家務活，掃掃地，給父母捶捶背，幫父母買點東西等等。
2.要注意個人安全等方面問題，不私自下河游泳，不能私自外出，不做危險違法的事。
3.要每天鍛煉身體，堅持跑步，每個星期天去爬一次山。每個星期六去游泳館游泳一次。每天還要早起，不睡懶覺。如果父母不在家，不能給陌生人開門，不跟陌生人講話.。見人要有禮貌。
這就是我的暑假計劃，我相信只要認真執行這些計劃我就一定能過一個美好，愉快的暑假!
小學生暑假計劃【2】
一、時間安排
1、每天的四個“1小時保障”
每天保障做一小時的語文或數學寒假作業;
每天保障一小時的無負擔課外閱讀;
每天保障一小時的英語自學;
每天保障一小時的戶外活動或運動。
2、計劃與非計劃
如無特殊情況，每天必須完成以上計劃;
每天的計劃在得到“保障”的前提下，可靈活自由安排;
如果因外出旅游、回鄉下度假等意外安排，可臨時不予執行;
可以偶爾睡懶覺，但不要影響當日計劃的實施。
二、學習計劃
1、不參加語文、數學的培優，不請家教，相關課程自己獨立完成。
2、語文課程計劃
7月份完成暑假作業，8月中旬前檢查、改正，查漏補缺;
把自己的藏書系統再讀一遍，重點讀歷史、百科知識大全、漫畫、中外名著導讀等叢書;
假期可以自己買三本自己喜歡的任何書籍;
把以前稍顯薄弱的閱讀題的規范回答、錯別字系統復習。
3、數學課程計劃
7月份完成暑假作業，8月中旬前檢查、改正，查漏補缺;
假期完成五年級《奧數提高班》的自學，基本掌握其要領，有選擇性挑選典型題目做。
自己注意計算細心化的糾正。
4、英語課程計劃
英語學習能力和成績一般，要重點加強學習興趣和能力的培養;
把三年級和四年級的學校課本系統復習一遍，每天堅持聽劍橋英語的磁帶，時間不限;
假期把以前記得的英語單詞都記在小本子上，分類匯總;
若有興趣、有機會，可以把語音和音標接觸、鞏固一下，盡量保證發音標準。
三、活動安排
1、隨父母至少省內出去旅游一次，爭取省外旅游去一次;
2、至少去鄉下親戚家2次，體驗生活，其中爺爺家族親戚去一次，外公家族親戚去一次;
3、每天保障一小時的戶外活動或運動，散步、溜冰、找小朋友玩等，要注意安全;
4、每兩天至少幫家里做一件家務事(10分鐘以上)，洗衣服、擇菜、簡單做飯等;
5、一個人嘗試獨立在家呆1-2天;邀請同學或者小朋友在家玩若干次，并獨立招待;
6、每周玩電腦2小時左右，重點加強打字能力的提高;
暑假到了，媽媽為了挖掘我的英語潛力，和我共同制定了學習計劃：天背兩個單元的單詞并默寫。自從計劃開始以后，我的社會便變得忙碌起來。
媽媽先教我學習音標。再教我26個英文字母，我經常把英文字母里的“r”語濱拼音里的“a”弄混。媽媽便讓我從前往后默寫，還打亂順序給我聽寫我終于能熟練地掌握26個英文字母的大小寫了。
接下來該背單詞了。開始我很盲目，讀十幾遍都背不過，心里想：就這么一個小小的單詞便讓我苦惱，那后面那么多單詞，我那年那月才能背過呢？我急的都快哭出聲了。媽媽走過來，語重心長地對我說：“崔煜東，你怎么了？”我說：“我記不住英語單詞！”媽媽說：“沒關系，我來教你怎么記。”媽媽先在所有的單詞上注上音標，再把方法告訴我：比如but這個單詞，“b”發“／b／”的音，“u”發／a／的音，“t”發／t／的音。連起來讀就是／bat／拼寫就是but。
自從用了媽媽教我的方法，我背單詞快多了。備課文、默寫課文也流利多了，每次都順利通過媽媽的檢查。現在又有一個好朋友魏志遠加入了我的隊伍。
雖然英語占用了我很多的時間，但是我樂意，因為IlikeEnglishverymuch！
考研英語詞匯app較好的有：
1、考研詞匯速記：可以智能制定學習計劃，有詞匯分組，單詞擴展，以及例句，更利于記憶。支持音標顯示、語音朗讀，智能循環記憶。詞義緩出，先單詞再中文，是方便易用的單詞軟件；
2、英語方舟考研：智能提供適合你的單詞列表，只背不會的單詞，節約學習時間，提高學習效率；
3、滬江開心詞場：科學的MAP記憶法提供全方位單詞記憶，讓背詞效果更好，效率更高。可以隨時和微信及QQ里面的好友進行單詞PK。生詞本提供多種便捷復習方式鞏固記憶。
（來源：文章屋網 ）
1、每天的四個“1小時保障”
每天保障做一小時的語文或數學寒假作業。
每天保障一小時的無負擔課外閱讀。
每天保障一小時的英語自學。
每天保障一小時的戶外活動或運動。
2、計劃與非計劃
如無特殊情況，每天必須完成以上計劃。
每天的計劃在得到“保障”的前提下，可靈活自由安排。
如果因外出旅游、回鄉下度假等意外安排，可臨時不予執行。
可以偶爾睡懶覺，但不要影響當日計劃的實施。
二、學習計劃
1、不參加語文、數學的培優，不請家教，相關課程自己獨立完成。
2、語文課程計劃。
7月份完成暑假作業，8月中旬前檢查、改正，查漏補缺。
把自己的藏書系統再讀一遍，重點讀歷史、百科知識大全、漫畫、中外名著導讀等叢書。
假期可以自己買三本自己喜歡的任何書籍。
把以前稍顯薄弱的閱讀題的規范回答、錯別字系統復習。
3、數學課程計劃。
7月份完成暑假作業，8月中旬前檢查、改正，查漏補缺。
假期完成五年級《奧數提高班》的自學，基本掌握其要領，有選擇性挑選典型題目做。
自己注意計算細心化的糾正。
4、英語課程計劃。
英語學習能力和成績一般，要重點加強學習興趣和能力的培養。
把三年級和四年級的學校課本系統復習一遍，每天堅持聽劍橋英語的磁帶，時間不限。
假期把以前記得的英語單詞都記在小本子上，分類匯總。
若有興趣、有機會，可以把語音和音標接觸、鞏固一下，盡量保證發音標準。
三、活動安排
1、隨父母至少省內出去旅游一次，爭取省外旅游去一次。
2、至少去鄉下親戚家2次，體驗生活，其中爺爺家族親戚去一次，外公家族親戚去一次。
3、每天保障一小時的戶外活動或運動，散步、溜冰、找小朋友玩等，要注意安全。
4、每兩天至少幫家里做一件家務事（10分鐘以上），洗衣服、擇菜、簡單做飯等。
5、一個人嘗試獨立在家呆1-2天。邀請同學或者小朋友在家玩若干次，并獨立招待。
6、每周玩電腦2小時左右，重點加強打字能力的提高。