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【關鍵詞】噬菌體生物擴增法;聚合酶鏈反應技術;結核;分枝桿菌
【中圖分類號】R378.91+1【文獻標識碼】A【文章編號】1007-8517(2010)16-159-2
結核分枝桿菌感染人體而引發的結核病是全球性的嚴重危害人類的傳染性疾病之一。我國作為發展中國家,結核病的控制更是任重道遠。在結核病控制中,尋求經濟,快速,敏感性和特異性較高的結核菌檢測方法,為結核的早期診斷提供依據是眾多臨床醫師所希望。目前痰熒光涂片靈敏度較差,并受痰樣本數和病情的影響,一般認為活動性肺結核涂陽率約40-50%[1];羅氏培養法陽性率較高約50-80%[1],但需要平均時間約4-8周。本研究通過PhaB法、熒光涂片法、PCR檢測法、羅氏培養法檢測肺泡灌洗液中結核分枝桿菌,通過對照評價PhaB法在肺結核診斷中的使用價值及優缺點。
1資料與方法
1.1臨床資料選取2008-2010年廣州市胸科醫院疑診初治肺結核住院患者80例,其中男性35例,女性25例,年齡19～65歲,平均年齡38.5±7.5歲。入選條件:疑診為初治肺結核并支氣管結核,未開始抗結核治療;三個月內未接受喹諾酮類和氨基糖甙類抗生素治療。
1.2方法
1.2.1PhaB法結核分枝桿菌噬菌體生物擴增試劑盒(FAST plaue TB)由英國BDTEC公司生產,由上海市金浩科技發展有限公司提供。
1.2.2支氣管沖洗液標本收集按支氣管鏡檢查常規進行術前準備和麻醉,通過胸部CT或胸片初步確定重點檢查部位。氣管鏡經鼻腔進入,通過聲門逐步檢查氣管,支氣管。對鏡下可見病變部位,可先后進行支氣管粘膜活檢和支氣管刷檢,隨后進行支氣管沖洗,將生理鹽水5～10毫升注入相應的肺葉和肺段病變部位進行沖洗,用吸引器將沖洗液收集入標本瓶中送檢,共2-3次。對鏡下病變部位不明顯處,將纖支鏡插入病灶最多部位所在的支氣管開口按上述方法進行刷檢、沖洗,留取標本。
1.2.3噬菌體生物擴增法按試劑盒(FASTPlaqueTBTM)說明書配制所需試劑,包括培養基-生物添加劑、瓊脂、噬菌體和敏感細胞等,全部操作在無菌操作臺進行。肺泡灌洗液洗標本的處理:取灌洗液標本5ml,加入1倍體積的4%NAOH溶液混勻常溫靜置15min去污染。加入磷酸緩沖液(PH6.8)離心20min,棄去上清液。重懸沉淀物,4000g離心15min,棄去上清液,重懸沉淀物,無菌條件下吸取1ml重懸液加入孵育管中,37℃孵育24小時。檢測:每次取1ml處理后的樣品加入各反應管中,陰性對照不加標本,陽性對照加入1:1000稀釋度的敏感細胞液。加入100ul噬菌體溶液在37℃條件下培育1h。在每個反應管中加入100ul強效殺毒劑溶液,上下充分混勻,室溫放置5min后加入5ml培養基-生長添加劑和1ml敏感細胞液。將反應管中所有反應混合物倒入培養皿中,加入5ml融化的瓊脂,快速混勻靜置成型。37℃溫育18-24小時后觀察結果。結果判斷:噬菌斑數19個陰性,20個位陽性。
1.2.4其他檢測方法熒光涂片法:用金胺“O”熒光染色涂片法,熒光顯微鏡檢每50個視野≥10-99條抗酸桿菌為陽性;結核菌培養:用BacT/Alert3D全自動分枝桿菌快速培養儀按照儀器使用說明書進行臨床標本的分離培養;熒光定量聚合酶鏈反應技術(PCR檢測):檢測沖洗液結核分枝桿菌DN段,TB-DNA基因拷貝數量>1×103拷貝/mL陽性
1.2.5統計學處理采用SPSS統計軟件進行分析,用X2檢驗比較不同檢測方法的陽性率,P
2結果
初步診斷為肺結核合并支氣管內膜結核的,未予抗癆治療的纖支鏡肺泡灌洗液標本80例。使用PhaB法、熒光涂片法、PCR檢測法、羅氏培養法四種檢測方法,PhaB法陽性率58.8%,熒光涂片法陽性率為47.5%,PCR檢測法陽性率65%,快速培養法陽性率76.3%。其中,PhaB法檢測陽性率明顯高于熒光涂片法,檢驗差異有顯著性意義(X2=4.27,P0.05),提示兩者陽性檢出率類似;PhaB法與羅氏培養法比較檢驗有顯著性差異(X2=12.07,P0.05)。
表一 80例初步診斷肺結核肺泡灌洗液使用PhaB法、熒光涂片法、PCR檢測法、羅氏培養法進行檢測陽性結果
方法 標本例數 陽性例數 陽性檢出率(%)
①PhaB法 80 47 58.8
②熒光涂片法 80 38 47.5
③PCR檢測 80 52 65
①③兩種方法聯合 80 58 72.5
④羅氏培養法 80 61 76.3
PhaB法檢出的47份陽性標本中,熒光涂片法檢出35例陽性;PhaB法檢出的33份陰性標本中,熒光涂片法檢出30例陰性。PCR法檢測的52份陽性標本中,PhaB法檢出41份,檢出率78.8%;羅氏培養法陽性的61例標本中,PhaB法檢測出44份,檢出率72.1%。
表二 80例初步診斷肺結核肺泡灌洗液使用PhaB法、熒光涂片法、PCR檢測法、羅氏培養法進行檢測結果比較
熒光涂片法 PCR檢測法 羅氏培養法
陽性 陰性 陽性 陰性 陽性 陰性
PhaB法 陽性(n=47) 35 12 45 2 47 0
陰性(n=33) 3 30 7 26 14 19
合計 38 42 52 28 61 19
3討論
1997年wilson等[2]人發現眾多的噬菌體中有一種分枝桿菌噬菌體能感染結核分枝桿菌和少數幾種非結核分枝桿菌。在經過處理的標本中加入結核分枝桿菌噬菌體,使噬菌體和分枝桿菌結合,隨后加入殺毒劑滅活未感染分枝桿菌的噬菌體。噬菌體在受感染的分枝桿菌內,利用其代謝酶系進行大量繁殖。當分枝桿菌破裂,大量的子代噬菌體被釋放,感染加入的敏感指示細菌,在培養基上經培養形成噬菌體空斑。當空斑數量>20個為陽性,否則為陰性。陽性的標本間接提示原標本有結核分枝桿菌或少數的幾種非結核分枝桿菌。這構成了噬菌體法檢測分枝桿菌的理論基礎[3]。據國外資料報道,2002年南非Albert[4]等人對疑似肺結核患者,以羅氏培養法為金標準,噬菌體法對痰標本檢測的敏感性73%,特異性為99%;巴基斯坦Muzaffar[5]等人用類似方法測得噬菌體法的敏感性82%,特異性98%;國內于秀麗[6]等人用BACTEC MGIT980快速培養法作為金標準,測得噬菌體法檢測痰中結核分枝桿菌的敏感性為86.4%,特異性83.9%。均顯示噬菌體法對痰中分枝桿菌檢測有較高的敏感性和特異性。
本研究用噬菌體生物擴增法、熒光涂片法、聚合酶鏈反應技術、羅氏培養法共4種方法同時檢測不同的纖支鏡肺泡灌洗液標本80份。PhaB法、熒光涂片法、PCR檢測法、羅氏培養法陽性檢出率分別為58.8%,47.5%,65%,76.3%。PhaB法和熒光涂片法陽性率比較,差異有顯著性意義(X2=4.27,P0.05);噬菌體生物擴增法以羅氏培養法為金標準,結果提示其敏感性77%,特異性100%,陽性預測值100%,陰性預測值57.6%。和國外以痰標本PhaB法檢測報道結果相似[4]。聯合PhaB法和熒光涂片法檢測敏感性為81.2%,特異性為100%,陽性預測值100%,陰性預測值57.6%;聯合PhaB法和PCR檢測法檢測敏感性為88.5%,特異性為89.5%,陽性預測值96.3%,陰性預測值89.5%。提示聯合PhaB法和PCR檢測法,能快速診斷肺結核,有較高的敏感性和特異性,在臨床中可能有較大的實用價值。這有待于更大的標本量進一步驗證。
結核分枝桿菌細菌學檢測是診斷結核的金標準之一,但患者排菌情況受結核病發現時期較大影響,對早期以滲出、增殖為主的病理改變,排菌量較小;而發生壞死,空洞形成的患者相對排菌量較大。同時病灶相連的支氣管引流是否通暢也影響遠端氣管內分泌物的排出,影響到痰結核菌的檢查。本組病例肺泡灌洗液標本PhaB法陽性檢測率較高,除了與病例的選擇有關,考慮原因:支氣管鏡檢查對支氣管、肺泡的機械性刺激,活檢鉗和毛刷損傷支氣管壁和病灶邊緣,同時在在纖支鏡活檢和刷檢后灌洗可起到疏通支氣管,促進遠端分泌物的排出。用生理鹽水在病變部位注入遠端氣道和肺實質,接觸病灶范圍較廣,負壓吸引收集沖洗液較多,細菌量較大,深部的結核菌可能被收集到沖洗液中。肺泡灌洗液對支氣管有刺激作用,可以誘發部分患者咳嗽,有利于深部結核菌的排出,獲得結核菌的機會增多[7]。另外,PhaB法是通過噬菌體感染結核分枝桿菌,而結核分枝桿菌受一些理化因素作用,表面受體發生細微變化可能導致不能被噬菌體感染[8]。相對痰標本,肺泡灌洗液標本受理化因素影響較小。
總結噬菌體生物擴增法對肺泡灌洗液標本分枝桿菌檢測的臨床應用。PhaB法操作簡便,獲取結果快速(2天),相對熒光涂片法有較高的敏感性和特異性。對PhaB法分枝桿菌檢測高特異性,臨床可以用于結核桿菌和非結核分枝桿菌的菌種鑒定[9]。針對噬菌體必須感染活的結核菌特性,臨床中還可以對標本加入不同的結核藥,對照不加藥標本,篩查結核菌株對不同結核藥的耐藥性[2]。
參考文獻
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【關鍵詞】淋病奈瑟菌；沙眼衣原體；解脲支原體；檢測分析
文章編號：1009-5519（2008）13-1962-02 中圖分類號：R446 文獻標識碼：A
我們于2000~2002年對自述泌尿生殖道感染的門診患者開展了淋病奈瑟菌（NG）、沙眼衣原體（CT）及解脲支原體（UU）的檢查，現將結果報道如下。
1 材料與方法
1.1 標本來源:按常規方法女性取宮頸分泌物，男性取尿道分泌物、前列腺粹等標本。近3年來在我院門診就診患者共獲取泌尿生殖道標本5 008份，其中男性標本2 759份，女性標本2 249份。
1.2 實驗材料
1.2.1 試劑：TM淋病奈瑟菌分離培養基（浙江軍區衛生防疫站）；解脲支原體液體培養基（廣州萬孚生物研究所）；單克隆抗體免疫熒光法沙眼衣原體特異性診斷試劑盒（軍事醫學科學院病毒所）；革蘭氏染液（自配）。
1.2.2 器材：消毒男性拭子及女性拭子、載玻片、甲醇、染色濕盒。
1.2.3 儀器： 孵育箱、熒光顯微鏡、光學顯微鏡，旋轉式振蕩器。
1.3 方法：接種：將消毒棉拭子所有的標本按淋病奈瑟菌，沙眼衣原體及解脲支原體的順序依次接種。（1）在TM培養基上分區劃線；（2）再將標本涂在無菌的載玻片上，以甲醇固定10 min，取出后于空氣中充分揮發；（3）最后將取有標本的棉拭子放于解脲支原體液體培養基中輕輕攪動后取出。
1.3.1 分離培養和鑒定：（1）接種后將TM培養基置于37 ℃，5%~10% CO2環境下孵育，18~24 h后，可形成直徑約0.5~1 mm、灰白色、光滑、半透明、呈露滴狀的圓形凸起菌落。可疑菌落先用氧化酶（+）試驗證實，然后作生化和免疫鑒定。（2）將固定在玻上的標本加抗衣原體熒光抗體25 uI，放入濕盒中，密蓋，置37 ℃溫箱孵育30 min，用含吐溫80的磷酸鹽緩沖液入洗槽中，放旋轉式振蕩器振蕩洗滌5 min，共3次，吹干，滴緩沖甘油作鏡油，于熒光顯微鏡下檢查。查見亮綠色，具有典型大小，邊界清晰的圓形顆粒、柱狀細胞內可見亮綠色包涵體，可報告“衣原體熒光抗體染色陽性”。（3）解脲支原體液體培養基置于35 ℃孵育24 h，觀察液體呈紅色清亮即為陽性；若不變色，再放24 h觀察，紅色、清亮為陽性，不變色為陰性。（4）將已固定的細菌涂片，按常規革氏染色后鏡檢。若男性急性尿道炎患者的膿性分泌物中呈現中性粒細胞內外有G-雙球菌，可報告為“查見G-雙球菌（細胞內外），”具有診斷價值。
2 結果
2.1 近3年來共計檢測標本5 008份，男性2 759份，3種病原體陽性共633份，檢出陽性率22.9%；女性2 249份，3種病原體陽性共433份，檢出陽性率19.3%。
2.2 1 006份陽性標本中，患者年齡分布：40歲104例占9.8%。3種病原體在不同性別人群中的檢出結果見表1。
2.3 在檢出的1 006例中NG陽性218例占20.5%，CT陽性196例占18.4%，UU陽性652例占61.1%。
2.4 各種病原體混合感染情況：NG與CT混合感染為18例，陽性感染率1.7%，其中男8例，女10例。NG與UU混合感染37例，陽性感染率3.5%，其中男13例，女24例。CT與UU混合感染為30例，陽性2.8%，其中男20例、女10例。NG、UU與CT混合感染為1例。
3 討論
3.1 隨著國內外交往日益頻繁，性意識和的改變，性傳播疾病已成為常見疾病，因此，開展性病防治、性病監測及開展新的檢測技術早期診斷，提高檢出率是衛生工作者的重點。
3.2 由于男、女生理上的差異，淋病在男性的臨床特征明顯，在門診直接用膿液涂片革蘭氏染色，陽性檢出率可達90%以上，無需再做細菌培養。而女性淋病患者，細菌培養有十分重要的意義。
3.3 本文對3年來我院性病門診疑為泌尿生殖道感染患者5 008例。分別或同時進行NG、CT、UU的檢測，病原檢測陽性者1066例，占被檢人數的21.3%，陽性率由高到低為UU（13%）>NG(4.4%)>CT(3.9%)。UU與NG、CT有顯著性差異（P
3.4 三種病原體的檢出中，陽性檢出的最小年齡為4歲，最大為70歲，青壯年是陽性檢出的主體；大多集中在20~40歲，占總檢出標本的81.1%。應加強這一年齡段的健康教育，以提高人們的文化素質、法制觀念、性道德觀念以及健康知識和自我保護意識[2]。
3.5 從表1可見，淋病奈瑟菌、沙眼衣原體及解脲支原體混合感染普遍，所以對尿道炎患者應同時進行三項聯檢測，防止漏診或誤診現象出現。
參考文獻：
[1] 于中麗，黨 肯.非淋球菌性病尿道炎病原體構成分析[J].陜西醫學檢驗，2000，15（1）：19.
關鍵詞：布魯氏桿菌；免疫磁珠；優化選擇性培養基
中圖分類號：S85 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20160932027
布魯氏桿菌，是馬耳他熱和波浪熱的病原菌，每年患者人數不斷增加，成為流行病學中高度關注的致病源。布魯氏桿菌主要通過畜產品和皮毛加工及養殖接觸傳染，寄生于細胞內，引起機體免疫力下降，可以導致患者喪失勞作能力和流產等，是食源性疾病中增長較快的一類致病源[1]。目前活菌培養依然是最好的評價布魯氏桿菌感染的方法，只要在標本中檢出，就可以確定食品的安全性并對布魯氏桿菌污染實現追蹤溯源。
1 材料與方法
1.1 Dynabeads M-280磁珠 （日本DYNAL社產）
EDC solution 液；NHS solution液；BST溶液；MEST洗液；羊布魯氏桿菌；羊布魯氏血清；羊抗兔Ig；馬血清；赤蘚醇；白細胞介素2；胰蛋白；葡萄糖；煙酸；生物素；維生素B1；D-環絲氨酸 ；甲基乙醚；多黏菌素B；桿菌肽；放線菌酮；制霉菌素；瓊脂粉。
1.2 磁珠的偶聯
將2mg 磁珠加入2mL Eppendorf管中，管中加入500uL MEST對磁粒子進行洗滌3次。加入EDC與NHS各2.5mg，調整反應體積為500uL，混勻后37℃恒溫活化0.5h，用MEST洗滌除去未反應的活化劑，換管洗滌2次。再用BST液洗滌2次，分散到BST中。加入抗血清300 uL，調整反應體積為500uL，4℃偶聯20h。用BST液洗滌4次，500μL保存液重懸偶聯好的抗體磁珠。
Dynabeads M-280 磁珠時用下列方法處理：取羊抗兔 Ig （G）0.5 mL，加1 mL PBS-Tween溶液混勻。離心，棄去上清液。再加1 mL PBS-Tween 液使磁珠重新分散懸浮其中。加羊布魯氏桿菌免疫血清1mL，4℃垂直于水平面、旋轉振蕩18h。上磁，棄液體。消磁，用1 mL洗液清洗，重復清洗5次。洗凈后免疫磁珠放4℃冰箱備用。
1.3 選擇性培養基配置
葡萄糖0.1g；赤蘚醇 0.2g；胰蛋白?12g；氯化鈉3g；馬血清23mL煙酸 0.5 mg；生物素 0.2 mg；維生素B10.5 mg；D-環絲氨酸 321.5mg；甲基乙醚1：20000；多黏菌素B 1：4000；桿菌肽 1：25000；放線菌酮1：100000；制霉菌素10000單位；硫酸鋅 2μg；氯化銅1μg；硫酸鈷 2μg；三氯化鐵27μg；三氯化鋁10μg；用蒸餾水定容至1L，pH =6.8。將上述培養基取200 mL添加1.5%瓊脂粉，制備成選擇性培養基，其余分裝成100mL/瓶選擇性增菌液。上述培養基在115℃， 20min條件下滅菌備用。
1.4 樣品測試
將布魯氏桿菌肉湯增菌后，用血球計數板法稀釋到每毫升含菌1×103CFU/mL，然后取0.1 mL分別添加到100g牛奶、100g羊腿肌肉、100g水樣品中，混勻成測試樣。
將上述樣品分別稱取25g于100 mL增菌液中，37℃、5%CO2條件下進行增菌培養24～48h。
1.5 免疫磁珠富集
吸取1mL增菌液，放入含有5mg免疫磁珠管內，室溫垂直旋轉振蕩20min。上磁架，固定磁珠，棄樣液。加1mL 洗液復混后同前操作。清洗4～5次后，加100uL PBS-Tween液使免疫磁珠和目標混勻備用。
1.6 選擇性分離培養和計數
將免疫磁珠混勻后移入標準一次性平板內，倒入45℃左右選擇性培養基，搖勻。或在預先鋪好的選擇性平板上采用涂布法涂布。將接好種選擇性平板在37℃，5%CO2條件下培養24～48h，計數。
1.7 培養結果和比較
挑取10株平板菌落，分別接種在生化管培養，符合以下生化反應的為羊布魯氏桿菌：革蘭氏染色-，觸酶+，氧化酶-，葡萄糖-，半乳糖-，阿拉伯糖+，硝酸鹽-，尿酶-，精氨酸-，H2S-，硫堇+，明膠-，吲哚-，MR-，VP-，枸櫞酸鹽-，甘露醇-。
計算公式：布魯氏桿菌=選擇平板總菌落數×（陽性株÷10），結果見表1。
2 討論
布魯氏桿菌的檢測逐步被分子學檢測所代替，但是不可否認分子學也存在著弊端，樣品中即便存在布魯氏桿菌的核酸但未必說明樣品具有生物可傳染性，經典的活菌培養法在確認布魯氏桿菌的生物安全性上具有更可靠性。
相比較，采用免疫磁珠聯合選擇性培養基法檢測布魯氏桿菌可以極大提高布魯氏桿菌的檢出限，這主要得益于優化的培養基豐富了布魯氏桿菌必須的生長因子及免疫磁珠的富集優勢，使得活菌培養法豐富了布魯氏桿菌的微生物學研究與檢驗方面實驗需要。
參考文獻
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受眾參與的新聞性：
受眾參與孕育了“互動性新聞”，這是互聯網新的新聞表現形式
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網絡媒體受眾參與孕育了一種新的新聞表現形式――互動性新聞。什么是互動性新聞？互動性新聞是建立在網絡媒體交互平臺上，經過受眾參與互動而產生的具有新聞價值的事實。互動性新聞具有鮮明的個性特征：一是具有傳受雙方互動交流的特質；二是具有第一時間、無限空間和廣泛參與性；三是具有現場（超）文本互動和二度傳播效能。
在互聯網這個最大、最具開放性、最富平等和活力的思想交流平臺上，受眾作為信息單向接受者的被動地位已經改變，他們毫無拘束地發表自己的意見、要求和愿望，直接參與各種新聞信息和思想觀點的傳播。受眾的參與內容成為主題報道的一個部分，是對報道主題的另一種深化和延伸。受眾互動和參與，摒棄了傳統媒體單純的宣傳、教育、告知的功能，最大限度地調動起普通受眾的參與熱情。受眾參與的雙重性，即心理上的間接參與和行為上的直接參與，又最大程度上刺激了受眾的積極性。讓讀者參與到重大主題報道中來形成互動，能提升重大主題報道的影響力并形成轟動效應。
中國寧波網圍繞紀念建軍80周年，精心策劃了“我是一個兵”八個一系列活動主題集約、形體發散、網民互動。充分發揮網絡媒體的及時性、互動性、表現多樣等優勢，把主題宣傳與網民參與有機結合起來，有100多萬人次直接和間接地參與了主題活動，得到了當地省市領導部門的高度肯定。
原創征文，回味軍旅。在天一論壇、博客開設“我是一個兵”征文專區。受眾講述動人的軍旅故事，有退伍軍人、軍人家屬、普通百姓等，征文200余篇，評出優秀征文近20篇。建軍感言，真情流露。在天一論壇和手機報紙中開設專欄，向全體網友征集“我對建軍節的一句話”。市民通過短信、電話、發帖、郵件等方式參與，共收集到300余條經典感言。軍旅照片，精彩紛呈。舉辦“紅色記憶?我眼中的80年”網上原創圖片展，征集網友原創貼圖，同時制作了專題頁面供網友上傳圖片，共收到作品200多份。軍事電影，眾人評說。由網友推薦以軍事為體裁的優秀電影共75部。最后由網友投票選出了“我最喜歡的軍事電影”。廣為熟悉的《小兵張嘎》、《上甘嶺》、《地雷戰》、《平原游擊隊》、《血戰臺兒莊》、《地道戰》、《閃閃的紅星》榜上有名。經典軍歌，風采再現。在論壇和網上廣播中向廣大歌友征集“我最喜愛的一首軍歌”，共百名網友用自唱自錄，老歌新唱等形式翻唱了革命歌曲。調查互動，體現民心。以“我看軍旅生活”為主題，開展一次以軍營生活為背景的網絡調查，就網民關心的問題開設網上問卷，上萬人次參與。創作網刊，深化主題。制作了建軍八十周年“我是一個兵”主題網刊，集文字、圖片、音樂、視頻、互動為一體，刊登各項活動中的優秀作品，回顧系列宣傳活動的效果。
受眾參與的互換性：
受眾參與改變傳媒與受眾關系，主題參與改變了傳媒價值取向
重大主題宣傳的受眾參與不僅是新聞“三貼近”的具體表現，也是新聞創新的一個原動力。加強主題宣傳的創新策劃，吸引受眾對新聞媒介的關注和對新聞事件、新聞報道全過程的參與是重大主題報道的一個重要內容。受眾的參與需求改變了傳媒與受眾的關系，也改變著媒體的傳統價值取向。受眾主動參與重大主題報道反映著新聞媒體傳播取向的轉換和互換。