時間：2023-08-31 16:37:23
導語：在生物信息學分析的撰寫旅程中，學習并吸收他人佳作的精髓是一條寶貴的路徑，好期刊匯集了九篇優秀范文，愿這些內容能夠啟發您的創作靈感，引領您探索更多的創作可能。
作者簡介：李潔（1982—），女，河南商丘人，實驗師，主要從事動物遺傳育種與繁殖工作。聯系電話：（0931）7631225。E-mail：lijie@gsau.edu.cn。
通信作者：王建福（1982—）男，河南商丘人，講師，主要從事水產養殖工作。聯系電話：（0931）7631225。E-mail：wangjf@gsau.edu.cn。
定西市安定區位于甘肅省中部，北緯35°17′54″至36°02′40″，東經104°12′48″至105°01′06″，南北長82.9km，東西寬73.3km，海拔1700～2580m，屬典型的黃土高原干旱半干旱雨養農業區，抗旱生產是安定區農業工作的重點。中晚熟玉米適宜海拔在2000m以下的區域種植[1]，而安定區大面積耕地海拔在2000m以上，中晚熟品種很難成熟，全膜雙壟溝播技術將玉米種植范圍擴大到海拔2100m區域[2-3]。為了考察早熟玉米新品種在安定區高海拔區的適應性、抗逆性、生產穩定性，2017年安定區農業技術推廣服務中心引進了7個早熟玉米新品種進行比較試驗，以期篩選出適合當地海拔2100m以上區域生產應用的玉米品種。現將結果報道如下。
1材料與方法
1.1供試材料
參試玉米品種7個，其中武科早303、武科早304由武威市武科種業科技有限公司生產，甘玉804由甘肅種業有限責任公司生產，興達1601、興達1602由甘肅興達種業有限公司生產，金穗606、金穗607及當地常規種植品種金穗3號（CK）由白銀金穗種業有限公司生產。
1.2試驗地概況
試驗設在定西市安定區團結鎮小山村，海拔2150m，年平均降水量430mm，年蒸發量1450mm，無霜期141d。前茬作物收獲后深耕曬垡，冬前淺耕耙耱。采用全膜雙壟溝播技術[4]，大壟寬70cm、高10cm，小壟寬40cm、高15cm。覆膜前結合整地一次性基施農家肥45000kg/hm2、玉米專用肥（N-P2O5-K2O為20-15-15）1200kg/hm2。用50%辛硫磷乳油7.5kg/hm2加適量水噴拌細土450kg制成毒土，撒施地面后起壟覆膜以防治地下害蟲。用50%乙草胺乳油3750mL/hm2兌水600kg噴灑于壟溝表面芽前除草。
1.3試驗方法
試驗為隨機區組設計，每品種為1個處理，3次重復，小區面積39.6m2（11.0m×3.6m）。4月19日用玉米點播器播種，每穴2粒，播深4cm，行距55cm，株距30cm，密度為60000株/hm2。田間管理措施同當地大田。田間觀察記載物候期及主要農藝性狀，成熟后按小區抽樣考種并單收計產。
2結果與分析
2.1生育期
從表1可以看出，各品種出苗期一致，均在5月2日。金穗607、武科早303、甘玉804、武科早304于6月中旬開始拔節，與金穗3號（CK）基本一致；興達1601、金穗606、興達1602拔節期較金穗3號（CK）遲13～16d。抽雄期武科早303、武科早304均為7月11日，較金穗3號（CK）早4d；興達1602與金穗3號（CK）一致；金穗606、興達1601、甘玉804較金穗3號（CK）晚2d。成熟期武科早303、武科早304、興達1602最早，8月下旬已經成熟，較金穗3號（CK）早9d；金穗607、甘玉804、興達1601、金穗606均在9月上旬與金穗3號（CK）同期成熟。生育期武科早303、武科早304、興達1602均為117d，較金穗3號（CK）短9d；其他品種生育期為126d，與金穗3號（CK）相同。
2主要性狀
由表2可見，株高以金穗607、甘玉804、興達1601最高，均為2.5m，較金穗3號（CK）高出0.5m；武科早304、金穗606次之，均為2.4m，較金穗3號（CK）高出0.4m；武科早303、興達1602最低，為1.7m，較金穗3號（CK）低0.3cm。穗位以甘玉804、金穗606最高，為80.0cm，較金穗3號（CK）高12.5cm；金穗607次之，為73.0cm，較金穗3號（CK）高5.5cm；武科早303最低，為36.5cm，較金穗3號（CK）低31.0cm。穗長以興達1601最長，為23.0cm，較金穗3號（CK）長5.0cm；其次為甘玉804，為21.5cm，較金穗3號（CK）長3.5cm；武科早304最短，為17.5cm，較金穗3號（CK）短0.5cm；其他品種較金穗3號（CK）長0.5～2.0cm。穗粗以金穗606最粗，為15.6cm，較金穗3號（CK）粗0.1cm，其他品種較金穗3號（CK）細0.2～2.3cm。軸粗以武科早304最粗，為10.8cm，較金穗3號（CK）粗0.8cm；其次是金穗606，為10.3cm，較金穗3號（CK）粗0.3cm；其他品種較金穗3號（CK）細0.3～0.7cm。粒型武科早304、興達1602與金穗3號（CK）一致，均為半馬齒型，其余品種均為馬齒型。粒色除武科早303、武科早304為黃紅色外，其余品種均與金穗3號（CK）一致，為黃色。軸色金穗607、甘玉804、興達1602為淺粉色；武科早303、興達1601、金穗606和金穗3號（CK）均為棕紅色；武科早304為白色。
2.3產量及構成因子
由表3可知，穗粒數金穗607最多，為630粒，較金穗3號（CK）多132粒；其次是甘玉804，為552粒，較金穗3號（CK）多54粒；其余品種均較金穗3號（CK）少。百粒重以金穗606最高，為31.6g，較金穗3號（CK）高8.2g；其次是武科早303，為28.4g，較金穗3號（CK）高5.0g；武科早304、興達1601分別為27.7、24.5g，較金穗3號（CK）分別高4.3、1.1g；其余品種均低于金穗3號（CK）。折合產量以武科早304最高，為8737.4kg/hm2，較金穗3號（CK）增產1186.9kg/hm2，增產率為15.7%；其次是武科早303，為8611.1kg/hm2，較金穗3號（CK）增產1060.6kg/hm2，增產率14.0%；金穗607居第3位，折合產量8585.9kg/hm2，較金穗3號（CK）增產13.7%；金穗606為8484.9kg/hm2，較金穗3號（CK）增產12.4%。對產量進行新復極差比較，各品種間產量差異均達到極顯著水平。
3小結
在安定區海拔2150m的旱區，對引進的7個玉米品種進行了引種試驗。結果表明，參試各玉米品種均可在9月中旬前成熟，武科早304、武科早303、金穗607、金穗606等4個品種綜合性狀優良。其中武科早304折合產量最高，為8737.4kg/hm2，較對照品種金穗3號增產1186.9kg/hm2，增產率為15.7%；武科早303折合產量8611.1kg/hm2，較對照品種金穗3號增產1060.6kg/hm2，增產率14.0%；金穗607折合產量8585.9kg/hm2，較對照品種金穗3號增產13.7%；金穗606較對照品種金穗3號增產12.4%。
張雷等人[5]認為全膜雙壟溝播栽培玉米可在海拔2300m以內的區域內種植。本試驗通過對供試玉米品種的性狀、生育期及產量結果進行綜合分析，建議在安定區海拔2100～2300m區域擴大武科早304、武科早303、金穗607及金穗606的種植面積，其他品種可在海拔2100m以下區域進一步試驗。
參考文獻：
[1] 劉廣才，楊祁峰，李來祥，等. 旱地玉米全膜雙壟溝播技術增產效果研究[J]. 農業現代化研究，2009，30（6）：739-743.
[2] 牛建彪. 半干旱區小麥玉米雨水高效利用技術模式[J]. 甘肅農業科技，2005（5）：22-23.
關鍵詞：鐵皮石斛，RCA2基因，克隆，生物信息學分析
中圖分類號：Q949.71
文獻標識碼：A
鐵皮石斛（Dendrobiumofficinale）屬于蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）多年生的草本植物，鐵皮石斛含石斛多糖、石斛堿、雙芐酚類、菲酚類等多種藥效成分，是石斛屬藥用植物中最為珍稀名貴的種，具有滋陰清熱、潤肺止咳、益胃生津、明目強身等作用（Zhangetal，2000）。核酮糖1，5二磷酸羧化酶/加氧酶（Ribulose1，5bisphosphatecarboxylase/oxygenase，Rubisco）是存在于葉綠體內的一個雙功能酶，同時催化卡爾文循環中最初固定CO2的反應以及光呼吸作用中的第一步反應，該酶處于光合碳還原和碳氧化兩個方向相反但又相互關聯的循環交叉點上，對凈光合速率起著決定性的影響，因此提高Rubisco活力是提高光合作用的重要途徑（潘瑞熾等，2004）。因鐵皮石斛原生地的生境破壞和常年的濫采亂挖，野生資源遭到嚴重的破壞，瀕臨滅絕，已列入中國珍稀瀕危保護植物的名錄。由于石斛不能夠栽培在土壤里，北方地區必須栽培在樹皮、木塊、鋸末等做的栽培床或者是石頭上，冬天多數需要蓋溫棚等設施，投資較大，加上石斛種植的技術要求高，目前市場尚未完全打開，發展速度還不是很快（張明等，2010）。
隨著生物技術的發展，許多糧食作物如大麥（Rundle&Zielinski，1991）、水稻（Toetal，1999）、大豆（Yinetal，2014）等植物的RCA基因被克隆，但目前報道的RCA基因很少有涉及藥用觀賞植物，最近有朱明庫等（2013）對羽衣甘藍Rubisco活化酶基因BoRCA的克隆、生物信息學及表達分析的研究；袁秀云等（2016）對蝴蝶蘭Rubisco活化酶基因PhRCAα的序列特征及在低溫脅迫下的表達分析的研究；祝欽瀧等（2011）對彩葉草Rubisco活化酶基因SsRCA進行了組織表達特異性和光誘導表達特性研究；曾淑華等（2012）已從鐵皮石斛中克隆了光合碳途徑關鍵酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因。因此，開展鐵皮石斛RCA基因研究顯得尤為必要。本研究為了提高石斛的質量，提高石斛光合效率，揭示鐵皮石斛光合作用機理自然成了鐵皮石斛研究領域的重要問題，該研究利用RACE技術克隆出鐵皮石斛RCA2全長基因，并進行生物信息學分析，為進一步研究鐵皮石斛光合作用調節機理奠定基礎。
1材料與方法
1.1材料
鐵皮石斛原產地為貴州，現在種植于河南省鄭州市鄭州師范學院蘭花工程技術研究中心智能日光溫室，植物材料為一年生鐵皮石斛。
1.2方法
1.2.1RNA提取選取一年生鐵皮石斛葉片，液氮速凍，保存于-80℃冰箱備用。葉片總RNA提取采用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（Tiangen公司）；采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性；采用QuawellQ5000微量紫外可見分光光度計測定其A260/A280值及其濃度。
1.2.2RCA2基因全長的克隆以提取的葉片總RNA為模板，用反轉錄試劑盒合成單鏈cDNA。根據GENBANK上已知植物的RCA保守區，利用DNAMAN和Primer5.0生物軟件設計兼并引物（表1），擴增RCA保守片段。PCR反應體系為20.0μL：10×PCRbuffer2.0μL、dNTPMix2.0μL、上游引物RCAF1（10μmol·L1）1.0μL、下游引物RCAR1（10μmol·L1）1.0μL、模板cDNA1.0μL、rTaq酶（5U·μL1）0.2μL，加滅菌雙蒸水至總體積20.0μL；反應程序為94℃預變性5min；94℃變性40s，56℃退火40s，72℃延伸40s，35個循環；最后72℃延伸10min。切膠回收目的片段，連接pGEMTEasy載體，轉化大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆送至上海英濰捷基生物技術公司測序，獲得RCA基因的保守區序列。再根據獲得的保守區序列，分別設計5′端和3′端特異性巢式引物（表1），以葉cDNA為模板，用巢式PCR方式分別擴增RCA的5′端和3′端序列，按Clontech公司SMARTerTMRACE擴增試劑盒操作說明進行反應，回收擴增目的產物，克隆到pGEMTEasy載體上，轉入大腸桿菌DH5α菌株，進行測序和拼接。
1.2.3ORF的擴增根據DNAMAN軟件拼接得到RCA基因序列全長，利用Premier5.0設計1對特異引物RCAF2和RCAR2（表1），用于完整開放閱讀框（ORF）的擴增。PCR擴增程序為94℃預變性5min，94℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，進行35個循環，72℃延伸15min。ORF片段連接到pGEMTEasy載體上，轉化大腸桿菌DH5α，測序進行ORF序列驗證。
1.2.4生物信息學分析利用ORFfinder進行開放閱讀框的預測；利用NCBI上的BLAST進行基因相似性的分析（http：//ncbi.nlm.nih.gov/blast/）；利用DNAMAN進行氨基酸序列比對分析；利用ProtScale程序（http：//expasy.org/tools/protscale.html）分析蛋白質親疏水性；利用TargetP軟件（UsingPLANTnetworks）和PSORTll（http：//psort.hgc.jp/form.html）進行亞細胞定位的分析；利用Protfun（http：//cbs.dtu.dk/services/ProtFun/）分析預測RCA2蛋白質結構功能和功能分類；利用ExPASy網站上的GOR進行蛋白質二級結構預測；利用ExPASy網站上的SWISSMODEL進行蛋白質三級結構的預測分析。
2結果與分析
2.1RCA2基因全長克隆
葉片總RNA提取后經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，檢測結果顯示，28S和18S條帶清晰，A260/A280值1.96，濃度為210.56ng·μL1。
以鐵皮石斛葉片總RNA反轉錄的cDNA為模板，以兼并引物RCAF1和RCAR2進行保守區片段PCR擴增，得到一個503bp保守片段（圖1：B），根據設計的3′端和5′端特異引物，采用RACE技術，擴增獲得3′端目的片段（圖1：D）和5′端目的片段（圖1：C）。利用生物軟件DNAMAN進行序列拼接得到該基因的全長為1730bp，利用ORFfinder分析，共有9個ORF，該基因最長的ORF共計1323bp，包含81bp的5′UTR、326bp的3′UTR，編碼440個氨基酸，將該基因命名為RCA2，GenBank登陸號為KT205842。利用引物RCAF2和RCAR2擴增獲得1323bpORF片段（圖1：A），連接到pGEMTEasy載體上測序驗證，得到的陽性質粒命名為pGEMRCA2。
2.2RCA2基因全長的生物信息學分析
2.2.1RCA2核苷酸及編碼蛋白序列的理化性質利用blastp和DNAMAN對RCA2氨基酸序列進行比對分析，發現該基因包含PloopNTPaseSuperfamily結構域，分別為“WGGKGQGKS”（A區）和“GKMCCLFINDLD”（B區），屬于PloopNTPase超家族基因（圖2）。理化性質分析該蛋白的分子質量為48.53kDa，等電點為6.19。將該基因全長核苷酸序列在NCBI上進行blastn相似性比較，結果表明基因均為RCA基因，且與蝴蝶蘭（Phalaenopsis）的相似性高達87%。氨基酸序列比對分析，發現其氨基酸序列與蝴蝶蘭、葡萄、荷花的相似性分別為89%、84%、85%（圖3）。
2.2.2RCA2編碼蛋白質的親疏水性分析利用ProtScale分析蛋白的親疏水性發現，RCA2蛋白質序列具有較高的親水性，其中第69位的Thr親水性最強（-3.078），第162位Leu的疏水性最強（2.122）（圖4）。
2.2.3RCA2編碼蛋白質的亞細胞定位蛋白的亞細胞定位與該蛋白所執行的功能是密切相關的，用TargetP和PSORTII軟件進行亞細胞定位分析，TargetP預測結果顯示RCA2蛋白定位于葉綠體基質，可信度為3（圖5：A），用PSORTII預測蛋白顯示，RCA2蛋白定位于葉綠體基質、線粒體基質間隙、葉綠體類囊體膜、葉綠體類囊體腔，RCA2蛋白主要存在于葉綠體基質（圖5：B）。
2.2.4RCA2編碼蛋白質的功能預測與分析利用ProtfunsoftwareofCBS分析預測RCA2蛋白質結構功能和功能分類，可能有意義的功能包括中間代謝、脂肪酸代謝、翻譯、輔酶因子的生物合成和能量代謝等，他們的幾率分別是5.484、4.387、4.048、3.639、3.098。這表明RCA2在中間代謝起到了一個非常重要的角色，在脂肪酸代謝、翻譯中起到了重要作用，在輔酶因子的生物合成和能量代謝中也起到了關鍵作用。
2.2.5RCA2編碼蛋白質的二級、三級結構預測采用ExPASy網站上的GOR進行蛋白質二級結構預測，結果表明，α螺旋占30.68%，延伸鏈占25.45%，不規則折疊占43.86%（圖6）。用ExPASy網站上的SWISSMODELWorkspace預測蛋白質的三維結構以4w5w.1.A（SMTLid）為模板進行建模，該模板以XRAY2.90方法產生，與RCA2蛋白一致性為86.02%（圖7）。
3討論與結論
該研究通過RTPCR和RACE技術方法，成功克隆了鐵皮石斛RCA2基因（GenBank登錄號KT205842）全長1730bp，開放閱讀框1323bp，編碼440個氨基酸；核苷酸序列分析結果表明，RCA2核苷酸序列與蝴蝶蘭（Phalaenopsis）的相似性高達87%，其編碼蛋白屬于PloopNTPaseSuperfamily家族基因。蛋白理化性質分析該蛋白的分子質量為48.53kDa，等電點為6.19，為親水性蛋白，RCA2編碼蛋白質的亞細胞定位于葉綠體基質；編碼蛋白質的功能包括中間代謝、脂肪酸代謝、翻譯、輔酶因子的生物合成和能量代謝等，蛋白質三級結構預測模型與RCA2蛋白一致性為86.02%，這些生物學參數為進一步研究RCA2蛋白的酶學性質及其在鐵皮石斛中的光合作用機理奠定了理論基礎。
關鍵詞：蓖麻（Riciuns communis L.）；油體固醇蛋白質；生物信息學
中圖分類號：S565.6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）11-2930-04
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.11.056
蓖麻（Riciuns communis L.）是大戟科（Euphorbiaceae）蓖麻屬（Ricicuns）一年或多年生雙子葉植物，廣泛生長在熱帶、亞熱帶和溫帶地區，是世界十大重要油料作物之一[1]。植物種子中有一種儲存營養物質的細胞器――油體[2-4]，其內部主要成分為三酰甘油，外部則為磷脂單分子層及嵌入其內的油體結合蛋白質組成的半單位膜[5]。油體結合蛋白質主要有三種――油脂蛋白質、油體鈣蛋白質和油體固醇蛋白質。油脂蛋白質由N-和C-末端兩個親水區域及中間疏水錨定區域組成。N-和C-末端暴露在油體表面，能夠提供空間位阻和負電斥力來維持油體的穩定[5]。Chen等[6]在油體中發現了3種微量蛋白質分別稱為Sop1、Sop2、Sop3。Sop1稱為油體鈣蛋白質。油體鈣蛋白質由N-端親水鈣結合區域、C-端親水性磷酸化區域和中間疏水錨定區域組成，可能在油體成熟、脂肪動員和提高油體穩定性方面發揮作用[5]。Sop2、Sop3被稱為油體固醇蛋白質-A和油體固醇蛋白質-B[7]。油體固醇蛋白質是一種羥基固醇脫氫酶，屬于SDR家族[8，9]。N-端的疏水區域由兩個親性α螺旋夾著一個疏水錨定結構組成，在此疏水區域中部有Pro knob結構[10]，其余部位分為NADPH、固醇結合區域和兩者之間的活性位點S-（12X）-Y-（3X）-K[10]。Sop3和Sop2蛋白質的固醇結合區域不同[7]。近來發現油體蛋白質也存在于根尖和芽等胚后組織中，推測在植物體內還存在未被發現的信號轉導通路[8]。本試驗以擬南芥蛋白質作“種子”在蓖麻的蛋白質數據庫中搜索，結合關鍵字搜索方法對蓖麻油體固醇蛋白質進行生物信息學分析，以期為該蛋白質的鑒定提供參考。
1 材料與方法
1.1 蓖麻基因組數據庫搜索
以“Steroid dehydrogenase”為關鍵字在蓖麻基因組數據庫（http：///search.php）中搜索，下載基因、cDNA和蛋白質序列；以6條擬南芥油體固醇蛋白質[11]作為“種子”，分別在蓖麻數據庫（http：///search.php）中進行Blastp搜索，E設為1×10-30，獲得同源的油體固醇蛋白質的基因、cDNA和蛋白質序列，去除重復后，再利用NCBI保守結構域分析工具（http：//ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi？）對所獲得的蛋白質家族進行鑒定，檢測是否有SDR（短鏈脫氫/還原酶超家族）的保守結構域。
1.2 蓖麻油體固醇蛋白質生物信息學分析
蓖麻油體固醇蛋白質的理化性質采用Protparam軟件進行預測；內含子、外顯子組成采用Spidey軟件進行分析；疏水性/親水性采用ProtScal軟件進行分析；蛋白質二級結構分析采用GOR4軟件進行分析；蛋白跨膜結構域采用TMHMM 2.0 Server軟件；信號肽結構采用SignalP4.1 Server軟件進行預測；蛋白質三維結構分析與同源建模采用CPHmodels軟件和RasMol-Raindy軟件；進化樹的構建采用軟件ClustalW2軟件和MEGA 4.1軟件，所有軟件使用的都是其默認值，部分分析軟件的網址見表1。
2 結果與分析
2.1 蛋白質的一級結構分析
2.1.1 氨基酸序列的理化性質分析 通過綜合分析，最終獲得11條完整的蓖麻油體固醇蛋白質基因，見表2。利用在線分析軟件Protparam對10種油體固醇蛋白質進行分析，得到其對應的氨基酸序列的理化性質，結果見表2。大部分蛋白質成員外顯子數為3或6，氨基酸殘基數為317～352，分子量為35.286 0～39.918 9 kDa，等電點PI為5.35～9.57。不穩定系數表明，有8種成員在植物內可能階段性出現。親水性大部分都為正值，大部分成員都為親水蛋白質。信號肽預測表明，這11個蛋白質不存在信號肽。由于Slo11蛋白質基因不完整，所以后續分析中只選擇其他10個蓖麻油體固醇蛋白質。
2.1.2 疏水性/親水性的預測和分析 采用ProtScale軟件對10個蓖麻油體固醇蛋白質進行分析，結果（圖1）表明，以Slo1、Slo9為例，1～40區域有強烈的疏水性，可能為跨膜區域與油體內部疏水的三酰甘油相接合處，其他區域無明顯規律。
2.1.3 跨膜結構的預測和分析 利用在線軟件TMHMM 2.0 Server對10個蓖麻油體固醇蛋白質進行跨膜結構預測，圖2結果表明，除了Slo5蛋白質在氨基酸25、200位點各有一個跨膜區，其他9個蛋白質（如Slo9）均只在25位點處有一個跨膜結構。
關鍵詞：弓形蟲；SAC1基因；體外擴增；生物信息學分析
中圖分類號：R382.5 文獻標識碼：A 文章編號：1007-7847(2007)04-0348-04
弓形蟲(Toxop1asma gondii)是一種專性細胞內寄生原蟲，可感染包括人類在內的所有哺乳動物的有核細胞，正常人感染弓形蟲后，多呈無癥狀帶蟲免疫狀態，但孕婦感染后，則可致流產、死胎以及胎兒先天畸形，弓形蟲作為一種重要的機會性致病原蟲，已成為導致免疫缺陷患者死亡的主要原因之一，sAC1是剛地弓形蟲速殖子主要表面抗原之一，其分子質量約為30kD，研究表明3AC1在弓形蟲入侵宿主的過程中發揮了雙重作用，它不僅在介導弓形蟲速殖子入侵宿主細胞的過程中發揮了重要作用，而且還可引發宿主體內強烈的抗原抗體反應，此種免疫原性特質，使其成為診斷性抗原與免疫性抗原的重要候選基因，本文根據RH株54C1基因序列參考相關文獻設計并合成了一對寡核苷酸引物，采用PCR技術從弓形蟲RH株基因組DNA中擴增編碼SAC1基因片段，并對其進行序列測定及生物信息學分析，為進一步通過基因工程進行表達做準備，同時也為體外研究弓形蟲SAC1基因的結構與功能及其在免疫診斷學中的應用打下了基礎。
1 材料和方法
1．1 材料
1．1．1 主要試劑及工具酶
TaqDNA聚合酶(Takara公司)；dNTPs、蛋白酶K(上海生物工程公司)；Tris堿、SDS、EDTA、酚、氯仿均為國產分析純。
1．1．2 蟲株
弓形蟲RH株由中山大學醫學院陳觀今教授惠贈。
1．1．3 實驗動物
SPF級昆明小鼠，6～8周齡，18～20g，購于廣東醫學實驗動物中心。
1．2 方法
1．2．1 引物的設計與合成
根據GenBank中弓形蟲54C1基因序列(序列號：S76248)311～1321位，設計一對引物P1和P2，P1：5'-ATGTCGGTTTCGCTGCACCACTT-3，，P2:5-TACGCGACACAAGCTGCGATAGAGCC-3'，引物由上海生工合成，并經PAGE純化。
1．2．2 弓形蟲基因組DNA提取
弓形蟲RH株速殖子復蘇后，每只0.3m1腹腔接種感染昆明小鼠，3～5d后，脫頸處死小鼠，腹腔注入2m1 PBS，收集腹水，PBS洗滌兩次，離心收集蟲體，加100mmo1/1Tris-C1，5 mmo1/1EDTA，200 mmo1/1 NaC1，1％SDS，100mg/1蛋白酶K，55℃震蕩過夜，然后分別用飽和酚、氯仿／異戊醇各抽提一次，等體積異丙醇沉淀，沉淀溶于100μ1三蒸水中，-20℃保存備用。
1．2．3 目的基因片段的PCR擴增
在0.2m1 Eppendoff管中依次加入下列成份：ddH2O 36.75μ1 10x緩沖液5μ1、dNTP(10mmo1/1)1μ1、正反向引物(20μmo1/1)各1μ1、模版DNA 5μ1，Taq酶0.25μ1，總反應體積為50μ1.95℃預熱10min后，94℃60s，50℃60s，72℃ 120s，行30個循環，將PCR產物5tx1在含溴化乙錠的1％瓊脂糖凝膠中電泳，UVP觀察結果并拍照。
1．2．4 DNA序列測定
PCR產物由上海英駿生物技術公司進行序列測定。并與GenBank中的基因序列(S76248)進行同源性比對。
1．2．5 克隆序列的生物信息學分析方法
利用ExPASy中的Trans1ate程序將jAC1基因的核苷酸序列翻譯成蛋白質氨基酸序列，通過protparam(us.省略/egi-bin/protparam)分析SAG1蛋白的物化參數，采用NCBI服務器中的CDD程序對氨基酸序列進行保守功能域分析，判斷該基因是否具有完整的保守結構域，進一步推斷對應的核苷酸序列是否具有完整的開放讀碼框，采用InterPro程序(ebi.ac.uk/InterProSean)對SWISS-PROT數據庫進行檢索，尋找氨基酸序列的功能結構域，了解目的序列可能的功能性質，利用NPS及Singa1 IP3.0及PSORT服務器，對蛋白質的二級結構及折疊類型、信號肽位置、亞細胞定位及跨膜螺旋域進行預測，進一步了解目的序列的基本特征。
2 結果
2．1 目的基因擴增
從弓形蟲RH株基因組DNA異擴增出編碼SAG1表面抗原基因片段，PCR產物行1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，
2．2 SAG1基因序列測定
以PCR擴增的特異引物，從正反兩個方向進行測序，雙向測序的結果相吻合，與GenBank中所給的基因序列(S76248)相比對，所擴增序列位于sAC1基因組DNA序列的311～1321處，共1006個堿基，包含了SAC1基因開放讀碼框內的所有堿基，擴增序列的第519位發生了G-A突 變，但并不影響其編碼的氨基酸序列，ACG及ACA編碼的均為蘇氨酸。
2．3 克隆序列的生物信息學分析結果
2．3．1 54C1基因的氨基酸序列
利用ExPASy中的Trans1ate程序將SAG1基因的核苷酸序列翻譯成蛋白質氨基酸序列，可知其編碼336個氨基酸，結果如下：
2．3．2 物理化學特性分析
通過protparam(us.省略/cgi-bin/protparam)分析SAG1蛋白的物化參數，分析結果表明，34C1分子質量為83495.2，理論等電點為5.04，在哺乳動物、大腸桿菌、酵母中的半衰期分別為4.4h(體外)、＞20h(體內)、＞10h(體內)，不穩定指數為46.93，脂溶性指數為24.73，兩親性指數為0.82。
2．3．3 保守結構域搜索
利用NCBI的CDD程序對SAG1的保守結構域進行搜索，結果顯示SAG1有兩個保守結構域，分別位于其氨基酸序列的54～176位及184～300位，這兩個保守結構域在介導弓形蟲對宿主細胞的粘附以及引發宿主免疫反應的過程中起到了重要作用。
2．3．4 氨基酸功能域搜索
采用InterPro程序對SWISS-PR07蛋白質數
據庫進行檢索，對SAG3的氨基酸功能域進行預測，對搜索結果進行分析總結，推測SAG3的氨基酸功能域可能位于54～176位與184～301位之間。
2．3．5 二級結構和折疊類型預測結果
NPS同源比對發現SAG1二級結構主要由α-螺旋，β-折疊和不規則卷曲組成，其中α-螺旋占18.75％，β-折疊占27.71％，無規則卷曲占59.71％。
2．3．6 信號肽預測
利用Singa1 IP3.0及PSOR了psort.nibb.ac.jp/form.htm1服務器對SAG1進行信號肽預測，結果顯示其編碼的氨基酸序列的前47個氨基酸為信號肽序列。
2．3．7 蛋白跨膜螺旋及亞細胞定位預測
應用PSORT Prediction對SAG1進行跨膜螺旋及亞細胞定位預測，發現其跨膜域位于第320～336位，為典型的Ia型跨膜蛋白，為GPI錨定蛋白，存在于細胞膜上的可能性為91％，在溶酶體膜上存在的可能性為20％，在內質網膜和腔內存在的可能性各為10％。
3 討論
自Burg JL對弓形蟲sA C1的全部基因序列發表后，國內外一些學者對弓形蟲幾個分離株進行PCR克隆、測序、表達，國內的陳曉光等曾試過在不同的表達系統中表達SAG1，包括在大腸桿菌中的非融合的pBV220系統和融合的pRSE了系統以及桿狀病毒系統，龔婭等以及陳曉光等分別構建了弓形蟲重組質粒pET-SAC1，使SAC1在PET系統中表達，朱翔等構建了PGEX-SAC1重組質粒，使其在PGEX系統中表達，我們從弓形蟲RH株的基因組中成功的克隆擴增出了SAC1基因序列，經測序證明，僅第519位發生了G-A突變，且為無意突變，并利用ExPASy中的Trans1ate程序將SAC1基因的核苷酸序列翻譯成蛋白質氨基酸序列后，利用生物信息學軟件分析得出其具有一定的疏水性，具有信號肽序列，信號肽剪切位點約位于第47位，為GPI錨定蛋白，跨膜域位于320～336位，為典型的Ia型跨膜蛋白，與國外學者實驗鑒定結果相符合。
關鍵詞：玉米（Zea mays L.）；淹水脅迫；誘導表達；啟動子
中圖分類號：S512.1；Q789 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）23-5880-04
洪澇災害給農作物造成了很大的損失，僅南亞地區每年有超過15%的玉米（Zea mays L.）種植面積遭受不同程度的危害[1]。玉米是我國種植面積最大的農作物之一[2]，但由于南方地區季節性降雨，玉米苗期經常遭受綿綿春雨，花期和灌漿期則往往遭遇梅雨，排灌系統不良、低洼地區的春玉米經常遭受洪澇災害。我國受洪澇災害的農田面積平均每年達956萬hm2，其中嚴重的年份，受災面積達1 500萬hm2以上[3]。
乙烯反應因子（Ethylene response factors，ERF）是乙烯信號途徑調控的重要因子，參與植物生物和非生物脅迫的表達調控[4-6]。研究發現ERF基因參與了水稻（Oryza sative L.）和深水稻的淹水脅迫響應。在淹水條件下Sub1A基因可以抑制乙烯的產生，限制葉片和節間的伸長，降低葉綠素的降解和碳水化合物的消耗，而使水稻生長處于“靜止”狀態，并在退水后能迅速恢復生長[7]。Xu等[8]克隆了Sub1A基因，并通過轉基因技術將Sub1A基因導入到不耐淹水的粳稻材料中，提高了耐淹水性。Hattori等[9]從深水稻中克隆了2個ERF基因，分別是SNORKEL1和SNORKEL2。淹水條件下，深水稻體內乙烯的積累，誘導了SNORKEL1和SNORKEL2基因的表達，促進了節間的顯著伸長，從而使深水稻的莖稈伸出水面，避免遭受溺亡。擬南芥（Arabidopsis thaliana）RAP2.2也是一個ERF基因，在根部表達量較高。轉基因結果證實上調RAP2.2基因的表達，提高了擬南芥耐淹水性，相反敲除RAP2.2基因，擬南芥對淹水非常敏感；同時，RAP2.2基因上調表達的轉基因株系，其ADH1和PDC酶的活性較高[10]。
以上研究表明，ERF基因參與了水稻、深水稻和擬南芥的淹水脅迫響應，是耐淹澇的關鍵基因。課題組使用生物信息學方法，從玉米基因組中獲得了107個ERF基因，并使用RNA-seq技術，分析了這些基因在玉米自交系Hz32（耐漬系）根系不同淹水條件下的表達情況，發現ZmERF2基因受淹水脅迫誘導表達（待發表）。本研究分別從玉米自交系Hz32和Mo17（敏感系）中克隆出了ZmERF2基因的啟動子，并對該啟動子進行了生物信息學分析，將有助于進一步揭示玉米耐漬性形成的分子機制。
1 材料與方法
1.1 材料
耐漬性較強的玉米自交系Hz32和耐漬性較弱的玉米自交系Mo17，均由華中農業大學張祖新教授惠贈。
1.2 方法
1.2.1 玉米基因組DNA的提取 利用改進的CTAB法[11]分別提取玉米自交系Hz32和Mo17的基因組DNA。
1.2.2 玉米根系總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成 玉米自交系Mo17、Hz32于三葉一心期，分別進行0、4 h的淹水處理。使用植物總RNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司），分別提取各處理根系的總RNA。將各處理的總RNA作為模板，使用cDNA第一鏈合成試劑盒（北京全式金生物技術有限公司），分別合成cDNA第一鏈。
1.2.3 PCR引物的設計 根據玉米自交系B73 ZmERF5基因序列，分別設計用于RT-PCR和PCR擴增的引物，引物序列見表1。引物GSP1-F、GSP1-R用于RT-PCR，分析不同淹水處理ZmERF5基因在Mo17、Hz32根系的表達情況。引物GSP2-F、GSP2-R用于PCR擴增ZmERF5基因啟動子。
1.2.4 ZmERF5基因表達的RT-PCR分析 分別提取淹水0、4 h處理的Mo17、Hz32根系總RNA，并分別合成cDNA第一鏈。將合成的cDNA第一鏈作為模板，進行RT-PCR分析。RT-PCR擴增體系為：10×Taq Buffer 2.5 μL，2 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 17.3 μL。RT-PCR擴增程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性60 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取8.0 μL RT-PCR產物以1%瓊脂糖凝膠電泳分析，并于凝膠成像系統拍照、保存。
1.2.5 ZmERF5基因啟動子的克隆 分別以Mo17、Hz32的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，擴增體系為：10×Taq Buffer 2.5 μL，2 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，Taq DNA 聚合酶 （5 U/μL）0.2 μL，50 ng/μL DNA 1.0 μL，ddH2O 17.3 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性60 s，63 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物以1%瓊脂糖凝膠電泳分析。
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【摘要】 目的 在大腸桿菌中表達人神經肽Y Y2受體，并對之進行純化、鑒定及生物信息學分析。方法 取已構建好且經測序確認無誤的重組質粒pET28aY2轉化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導表達融合蛋白，并經SDSPAGE檢測和Western 印跡鑒定，表達產物包涵體經Ni2+NTA親和層析純化。然后利用相關在線軟件進行生物信息學分析Y2受體蛋白。結果 經IPTG誘導含有pET28aY2重組質粒的DE3菌，表達出重組人Y2融合蛋白。重組蛋白經Ni2+NTA親和層析進行純化后，得到了較高純度的融合蛋白。經相關在線軟件分析后獲得了Y2受體的相關生物學特性。結論 重組質粒pET28aY2在大腸桿菌DE3中成功表達，親和層析純化后獲得較高純度融合蛋白，并對Y2受體蛋白的生物學特征進行了預測，為進一步研究其生物學功能及其抗體的研制奠定了基礎。
【關鍵詞】 人神經肽Y Y2受體;融合蛋白;包涵體;純化;生物信息學
【Abstract】 Objective To express human Y2 receptor protein in E. coli，purify and identify it，and conduct bioinformatic analysis of Y2 receptor protein. Methods The recombinant plasmid pET28aY2 which had been well constructed and sequentially confirmed was transplanted into E.coli BL21(DE3) and induced by IPTG to express fusion proteins. SDSPAGE and Western blot were used to test and identify the expressed fusion proteins. The inclusion body of the expressed product was purified by Ni2+NTA affinity chromatography. Then bioinformatic analysis of the Y2 receptor was conducted with the help of related online software. Results After being induced by IPTG，the DE3 with recombinant plasmid pET28aY2 expressed recombinant human Y2 receptor protein. Highly purified fusion protein was obtained by Ni2+NTA affinity chromatography. Related biological characteristics of Y2 receptor were obtained after the online software analysis. Conclusions The recombinant plasmid pET28aY2 can be successfully expressed in DE3. Highly purified proteins can be obtained by Ni2+NTA affinity chromatography. Y2 receptor′s biological characteristics are predicted， which lays foundation for further studies of Y2 receptor protein′s biological function and antibody development.
【Key words】 NeuropeptideY Y2 receptor; Fusion protein; Inclusion body; Purification; Bioinformatics
神經肽Y(NPY)是由36個氨基酸組成的多肽，屬于胰多肽家族，作為一個信號分子在不同物種間有高度的保守性。人體內NPY相關的受體主要存在于中樞神經組織中，此外在外周組織也有分布。其中與脂肪組織相關的受體主要有Y1、Y2和Y5〔1，2〕。NPY通過與其受體Y2(NPY2R)的作用刺激內皮細胞增殖分化，在血管生成過程中重要的作用〔3，4〕，Kuo等〔1〕的研究表明NPY在脂肪重塑、飲食誘導的肥胖加劇及伴隨的代謝綜合征形成中有重要的作用。他們認為，NPY與NPY2R相互作用，通過血管生成引起內皮細胞及脂肪細胞的增殖、分化，表明NPY及NPY2R可作為媒介用以增加移植脂肪組織的體積和存活。
1 材料與方法
1.1 材料 E.coli BL21(DE3)、含有測序正確的重組質粒pET28aY2的保存菌均由本室保存;蛋白Marker購自TaKaRa公司;鼠抗人Anti6×His抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG 均購于天根生化科技有限公司;鎳離子親和層析預裝柱及化學發光顯色試劑購于QIAGEN公司;蛋白電泳儀、電轉移儀(BioRad公司);cientzIID超聲細胞粉碎機為寧波新芝科器研究所產品;其他所用試劑均為國產分析純。
1.2 方法
1.2.1 重組人NPY2R融合蛋白的誘導表達 用接種環沾取少量含有重組質粒pET28aY2的保存菌，于LB(Kan+)平板上劃線，37℃倒置培養過夜。次日挑取單菌落，接種于5 ml LB (Kan+ )液體培養基，37℃振搖培養過夜。次日取培養過夜菌液500 μl 再接種于50 ml選擇性LB 液體培養基中，振蕩培養至OD600值達0.6。吸取1 ml后加入IPTG，終濃度為1 mmol/L，37℃繼續誘導培養4 h。取加IPTG前和后的菌液各1 ml，12 000 r/min離心5 min，收集菌體沉淀，并于沉淀中加50 μl蒸餾水，混勻后再加2×SDSPAGE上樣緩沖液50 μl，混勻，沸水浴5 min，12 000 r/min離心10 min，每個樣品取20 μl上樣于10%的SDSPAGE凝膠電泳，電泳結束后取考馬斯亮蘭R250染色2 h，然后脫色，拍照記錄結果。
1.2.2 包涵體的釋放 據上所述，在2 000 ml的搖瓶中裝500 ml的LB液體培養基擴大誘導規模。將誘導表達菌液，4℃，5 000 r/min，離心15 min，收集菌體沉淀;加入25 mlPBS，吹打充分懸浮菌體沉淀，4℃，12 000 r/min，離心30 min，棄去上清，依此反復沖洗菌體沉淀3次;加入細胞裂解液25 ml，吹打使菌體沉淀均勻懸浮;將菌體沉淀懸浮液置-20℃冷凍，再于室溫融化，如此反復凍融3次;4℃，12 000 r/min，離心細菌凍融液30 min，棄去上清，在沉淀中加入超聲裂解液25 ml，吹打混勻;置冰上對細菌凍融液進行超聲處理，10 min/次，處理時間30 min;超聲處理后，于4℃，12 000 r/min，離心30 min，棄去上清，沉淀為菌細胞裂解沉淀物。
1.2.3 包涵體的提純 于菌細胞裂解沉淀物中加入含4 mol/L尿素的包涵體提純液25 ml，吹打混勻，室溫靜置30 min，12 000 r/min離心30 min，反復3次，即得到包涵體沉淀物。
1.2.4 包涵體的裂解 于包涵體沉淀物中加入包涵體裂解液25 ml，吹打混勻，室溫靜置6 h，使包涵體充分裂解，2 000 r/min離心30 min，收集上清液，即為包涵體裂解物。
1.2.5 變性蛋白的復性 將收集的包涵體裂解物上清液加入到處理過的透析袋中，扎緊透析袋兩端;將透析袋整體浸沒于蛋白復性液，在4℃條件下透析;復性液中的尿素濃度從7～1 mol/L依次遞減，在每個尿素濃度梯度復性液中透析3～4 h。每次更換不同尿素濃度復性液之前，需要將透析袋內的樣品吸出，4℃，12 000 r/min，離心30 min，再把上清液加入透析袋內，重新扎緊進行透析;透析完畢后，將樣品取出，4℃，12 000 r/min，離心30 min，再將上清液加入透析袋，在4℃預冷的PBS中透析20 h;取出透析好的樣品，4℃，12 000 r/min，離心30 min，收集上清液即為復性產物。-70℃保存。
1.2.6 復性產物的純化 ①上樣：將復性產物緩慢加于已用PBS緩沖液平衡的鎳離子親和層析預裝柱中，加樣所用的流速要控制在1 ml/min以內;②沖洗：PBS洗滌除去未結合蛋白，沖洗流速應控制在5 ml/min以內;③洗脫：分別用含50、100、150 mmol/L咪唑PBS緩沖液洗脫融合蛋白，流速5 ml/min。
1.2.7 純化產物Western印跡檢測 取純化后產物20 μl上樣于10%的分離膠SDSPAGE電泳后，電轉移至硝酸纖維素膜上，進行Western印跡分析。一抗為鼠抗人Anti6×His(1∶1 000稀釋)，二抗為辣根過氧化物酶偶聯的羊抗鼠IgG抗體(1∶5 000稀釋)，采用化學發光法顯影，于X光片上曝光。
1.2.8 生物信息學 對所表達的NPY2R融合蛋白分別利用在線軟件(expasy.org/tools/protparam.html)進行氨基酸組成及理化性質分析;利用在線軟件(ca.expasy.org/tools/protscale.html)進行疏水性分析;利用在線軟件(ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)進行跨膜分析;利用在線軟件(cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行信號肽分析;利用在線軟件(npsapbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html)進行二級結構預測;利用在線軟件(swissmodel.expasy.org/workspace/index.php?func=modelling_simple1)對三級結構進行預測;最后利用Harvard大學的在線生物信息學軟件(bio.dfci.harvard.edu/Tools /antigenic.html) 進行抗原表位預測。
2 結 果
2.1 誘導pET28aY2表達NPY2R結果 pET28aY2表達的NPY2R在N端有非NPY2R的36個氨基酸的融合蛋白，其中有6個組氨酸的tag(Histag)，目的蛋白NPY2R由381個氨基酸組成，即pET28a2Y表達的完整融合蛋白由417個氨基酸組成，分子量約47 kD。見圖1。
2.2 融合蛋白純化后的鑒定 NPY2R蛋白在含150 mmol/L咪唑PBS緩沖液可以完全被洗脫，分別進行10%的SDSPAGE電泳鑒定，見圖2。
2.3 純化蛋白的Western印跡結果 用化學發光法顯影，X光片曝光后可見一清晰條帶，表明目的蛋白得到有效表達和純化，見圖3。
2.4 NPY2R的生物信息學分析
2.4.1 氨基酸組成及理化性質分析 利用expasy.ch中的Expasy protparam tool對NPY2R的理化參數進行預測。預測編碼區編碼的氨基酸數目為417個。堿性氨基酸總數(Arg+Lys=35)等于酸性氨基酸總數(Asp+Glu=35) 。預測相對分子量為46.55 kD，等電點pI為7.27。其半衰期在體外哺乳動物網織紅細胞為30 h，在酵母體內大于20 h，在大腸桿菌體內大于10 h。不穩定系數為31.63，歸類為穩定蛋白(當一個蛋白質的不穩定系數>40時，則該蛋白質不穩定)。
2.4.2 疏水性分析 蛋白質分子的基本特性之一是親水的極性部分在分子的表面，疏水的非極性部分在分子內部。因此，根據每種殘基的極性和氨基酸序列就能較容易地了解到一級結構中不同肽段的極性，從而估測出不同肽段在分子內外的定位。用Expasy軟件估測了NPY2R極性，結果見圖4。橫坐標為蛋白質氨基酸殘基的序號，縱坐標表示殘基的疏水親水的特性;正值為疏水，負值為親水。從圖中可以看出，NPY2R具有較強的疏水性，位于分子的內部。
圖4 NPY2R的疏水性分析
2.4.3 跨膜性分析 膜蛋白主要有兩大類:內膜蛋白和外膜蛋白，內膜蛋白與細胞膜結合的主要方式是肽段直接跨過細胞膜，即跨膜蛋白，另外還可以通過脂肪基與細胞膜發生共價結合，蛋白可在胞內，也可在胞外。跨膜蛋白在細胞中常以離子通道形式存在，執行信號傳導或物質轉運功能。利用在線軟預測，發現有7個跨膜結構區(如圖5示，X軸為氨基酸系列位置，Y軸為氨基酸平均疏水指標)。
圖5 NPY2R的跨膜性分析
2.4.4 信號肽分析 將NPY2R蛋白序列提交到在線軟件分析NPY2R是否有信號肽存在，輸出結果見圖6，NPY2R蛋白N端1～70位氨基酸序列中沒有發現明顯的信號肽酶切位點，Y平均值較低，未發現信號肽序列存在。因此，推測NPY2R不存在信號肽，該蛋白不是分泌蛋白。
圖6 NPY2R的信號肽分析
2.4.5 二級結構分析 預測結果見圖7，表明NPY2R蛋白的二級結構由49.40%的α螺旋、13.43%的延伸鏈、37.17%的無規卷曲組成。
圖7 NPY2R的二級結構分析
2.4.6 三級結構分析 蛋白質高級結構的預測和分析，對理解蛋白質結構與功能之間的相關性有著極其重要的意義。將NPY2R的氨基酸序列提交給SWISSMODEL三級結構預測服務器，未能生成預測的結果。
2.4.7 抗原性分析 利用在線軟件對NPY2R的抗原性進行分析，結果見圖8，有10個抗原決定簇可供選擇，以便進行相關實驗。
圖8 NPY2R的抗原性分析
3 討 論
NPY2R缺失小鼠能夠明顯減少攝食、降低脂肪沉積和減輕體重〔5〕，在大鼠和小鼠外周注射NPY2R 抑制劑PYY3236 均可抑制攝食，降低體重，而在NPY2R 缺失模型鼠中卻無此作用〔6〕。這表明NPY2R與攝食和肥胖密切相關。為了探明是否NPYNPY2R信號系統能剌激體內脂肪量的增加，研究者使用遺傳性的肥胖鼠B6.VLepob/J，這種鼠具有能進行中樞性的調節攝食過量、削弱新陳代謝及減少交感性嗜鉻細胞活性的特點。與對照組鼠相比，這些鼠血清NPY水平高出正常值的200%，并且明顯地上調腹部皮下脂肪的NPY及其受體Y2的表達。這也支持了一種觀點，即循環的NPY來源于脂肪組織。利用腹部皮下脂肪源性的NPY進行處理后，可觀察到在肥胖及消瘦鼠體內脂肪組織的質量及體積增加了50%。而相反的是，注射NPY Y2受體拮抗劑可降低肥胖及消瘦鼠體內脂肪量及體積的50%。
Baker 等〔7〕研究表明NPY與Y2受體作用可引起機體內新的脂肪生成，并可減少機體對移植脂肪的吸收。他們以鼠及猴為對象進行的研究表明將包有NPY并能穩定釋放14 d的緩釋藥片植入到鼠的皮下組織中，在藥片植入的周圍會有新的脂肪生成，而且這種脂肪能夠至少維持3個月。同時將含有NPY的藥片植入到兩只猴子腹部的皮下組織中，NPY的用量與給鼠的用量一樣，但1個月后通過MRI檢測，同樣可以觀察到脂肪細胞的生成。
本課題組在完成重組人源化NPY2R基因克隆及序列分析〔8〕的基礎上，將NPY2R基因與pET28α載體連接后表達于DE3中。pET28α表達載體在N端含有HisTag寡聚組氨酸鏈，因此，表達出的融合蛋白在多種情況下都可以便利地和經濟地進行純化。本課題組設計的NPY2R融合蛋白N端為36個氨基酸組成的非目的蛋白，其中包含一個Histag，其后的目的NPY2R蛋白有381個氨基酸。即pET28aNPY2R表達的融合蛋白共由417個氨基酸組成，分子量約50 kD左右。用6×histag抗體進行western 印跡鑒定，表明有大量融合蛋白產生。其分子量與NPY2R融合蛋白相符。目前已完成包涵體的裂解、復性及純化，其生物學活性還有待測定。此外，本課題組利用生物信息學軟件對天然NPY2R在一級結構、二級結構、三級結構等多方面進行了分析和預測，并對其生物學性狀有了進一步的了解，為今后以NPY2R為對象進行的研究準備了物質及理論基礎。但是，對于NPY2R融合蛋白的生物信息學分析尚待進一步研究。
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[關鍵詞] 同位單核苷酸多態；人表皮生長因子前體蛋白；非同位單核苷酸多態；生物信息學
[中圖分類號] R786 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）01（a）-0014-05
人表皮生長因子前體蛋白（prepro-epidermal growth factor，preproEGF）mRNA/cDNA序列由24個外顯子組成，長約5 kb，編碼一條1207個氨基酸的蛋白多肽鏈，該肽鏈在翻譯生成后經蛋白酶剪切加工形成的成熟表皮生長因子（一段53個氨基酸多肽）對人體表皮細胞的生長、分化和代謝起著十分重要的作用[1]。也許由于mRNA序列轉錄的選擇性剪接加工等生物學機制的緣故，基因在表達時常常會出現蛋白多肽變體，目前已知的preproEGF變體有腎源和其他組織源兩類。另一方面，preproEGF基因序列的遺傳多態，特別是單核苷酸多態（single nucleotide polymorphysims，SNPs）也可致其出現變體或功能改變，還可引起疾病的發生[2-3]，例如，迄今的研究已表明，分布在preproEGF基因第61 bp位點的SNP（A/G）與歐美人某些腫瘤例如黑色素瘤等發生具有相關性[4]。可見深入探明SNPs及其在preproEGF基因或mRNA/cDNA中的分布情況對于探索疾病相關性的研究頗具指導價值和醫學意義。至目前為止，SNPs在preproEGF基因組DNA序列內之生物信息學分布及其在第20、21外顯子和其間內含子區段中呈現稀疏分布的特點于近期已見報道[5-6]，但其在mRNA/cDNA序列中的情況如何則尚待探明。本研究擬借助NCBI的生物信息學平臺對SNPs及其在preproEGF核酸或mRNA/cDNA序列中的分布進行分析定位和標注圖解，為進一步的疾病相關性研究和醫學應用提供基礎。
1 對象與方法
1.1 研究對象
人preproEGF基因和蛋白多肽及其變體的mRNA/cDNA序列。
1.2 儀器和信息資源
計算機（聯想公司）、電訊寬帶網路（中國電訊）、NCBI的生物信息程序和dbSNP。
1.3 方法
從電訊寬帶登錄網址nlm.nih.gov，參照研究介紹的方法檢索分析和定位注釋存在于preproEGF多肽及其變體mRNA/cDNA序列中的SNPs[7-9]。
2 結果
經Blast和Entrez SNP檢索到在人4號染色體上分兩類preproEGF多肽的mRNA/cDNA序列中存在有不同數目和種類的SNPs，可依其rs#從5'端到3'端行順序編號并歸位其在核酸序列中的位點，同時計算各相鄰SNP位點之間的距離。見表1、2。
由表1、2可見，編號于人兩類preproEGF多肽mRNA/cDNA序列中的SNPs在種類數目上有所不同，即腎源類SNPs為51個，而其他組織源類卻為55個，總計106個SNPs。進一步觀察對比這兩類SNPs可見，其大多數（84個或42對）是位點及種類皆同一或同位的，主要分布在外顯子序列中；而少數（腎源類9個，其他組織源類13個）卻表現出非同位或各自不相同的，主要分布在3'端非編碼序列中。合并表1和表2的資料信息，可繪制成SNPs及其在兩類preproEGF多肽mRNA/cDNA序列中的分布圖。見圖1（封三）。
由圖1（封三）可見，在第1～5、10、13～15、20～21和第24外顯子中總計分布有30對同位點SNPs；在第9外顯子中分布有1個腎源類非同位點SNP；在第6～8、11～12、16～19和22～23外顯子中沒有SNP分布；7個腎源類非同位點SNPs或12個其他組織源類非同位點SNPs分別分布在其3'端非編碼序列中。
3 討論
本研究應用生物信息學技術對存在于人preproEGF多肽mRNA/cDNA序列中的SNP及其分布情況進行了檢索分析，結果得到共計106個位點及其SNPs分別分布于兩類（腎源和其他組織源）mRNA/cDNA序列中。深入對比觀察這些結果首先可見，分布于兩類序列的42對共計84個SNPs因其相鄰SNP間距相等而初步顯示彼此的SNP位點及種類（RefSNP和亞SNP）皆具同一性；如果對比分析表1、2中的SNP位點也不難發現42對SNPs在兩類mRNA/cDNA序列間之位點差距皆為16 bp，這說明分布于兩類序列中的這些SNPs確實是位點及種類相同或同一的，本文將其簡稱為同位SNP。其次，觀察分析結果也可見表1、2中有22個SNPs因其相鄰SNP間距既不相等也不遵循兩序列間相應位點之差距為16 bp的規律并且還數目不等地分別分布于各自歸位的mRNA/cDNA序列中而表現出各自不同的位點差異性，對此本文稱其為非同位SNP。
觀察圖1（封三）可見，分布在mRNA/cDNA序列編碼區的SNPs絕大多數（97%）都是同位SNP對，這可能是為了維穩兩類preproEGF多肽的遺傳需要所決定的，因為依靠同位SNPs彼此間的高度同一性，方可確保由這些SNPs組成的密碼子在分別編碼兩條蛋白多肽鏈時不會引起相應位點的氨基酸（AA）彼此出現差異從而改變蛋白多肽之結構和功能。然而，分布在序列編碼區的個別SNP也有不是同位SNP的例外情況，例如，第9外顯子內的015號SNP（R-1816）即不是同位SNP，而是一個屬于腎源類的非同位SNP 。由于這個非同位SNP是位于蛋白多肽編碼區內，因而頗有可能令其編碼的AA有別于其他組織源preproEGF多肽序列相應位點的AA。一方面造成腎源類preproEGF多肽在結構或生物學特性方面有別于其他組織源類preproEGF多肽；另一方面因為造成蛋白多肽的結構和功能改變而導致疾病發生。盡管有如此可能的風險，但由于這個非同位SNP所歸位的第9外顯子并不參與編碼53個AA多肽的成熟EGF，因而不太可能對成熟EGF的結構和生物活性造成影響或帶來改變。不過，由于第9外顯子參與編碼一段類似EGF的同源多肽和一段低密度脂蛋白（LDL）受體同源肽段，因而這個非同位SNP還是有可能影響到腎源類preproEGF多肽與其他組織源類preproEGF多肽出現結構和生物學特性差異的[1，10]。當然事實是否果真如此迄今仍缺乏直接的證據，不過已有相似的例子見于研究報道，研究發現，位于腎源類preproEGF多肽mRNA/cDNA序列第22外顯子中的一個單核苷酸由C變成了T，也即C3209T，因而使得preproEGF多肽鏈第1070位AA也相應地從脯氨酸變成了亮AA，即P1070L；同時，該研究還發現由于這個AA的改變導致了腎源preproEGF多肽維持體內Mg2+平衡之生物學功能隨之改變進而引發了低Mg2+血癥[11]。此外，也有報道觀察到：腎源preproEGF多肽加工生成成熟EGF的場所是位于細胞之外，而其他組織源（例如下頜下腺、胰腺、前列腺等組織）的preproEGF加工生成成熟EGF則是在細胞內完成的；反之，在頜下腺、胰腺和乳腺等組織，preproEGF可被剪切加工生成成熟的EGF，但是在腎臟，preproEGF則不被剪切加工生成EGF[1]。據此推測，兩類preproEGF多肽之間所展示的這些生物學特性差異也許會有一些SNP的影響因素在里面。其次，觀察圖1（封三）也可見分布在mRNA/cDNA序列非編碼區的SNPs大多不是同位而是非同位SNPs。然而，一個有趣的現象是這些非同位SNPs極少分布在序列5'端非編碼區，而是大多集中分布在了3' 端非編碼區，具體的分布情況是：在兩類mRNA/cDNA序列之5'端非編碼區可見腎源類或其他組織源類SNPs各自僅分布了1個非同位SNP；而在序列之3'端非編碼區腎源類SNPs卻集中分布有7個非同位SNPs，其他組織源類更是集中分布了12個非同位SNPs。至于這些非同位SNPs的集中分布對preproEGF多肽有何生物學意義目前還不十分清楚，不過如果依據DNA元素百科全書研究項目對非編碼核酸序列之生物學功能的發現和理解并且結合這些非同位SNPs集中分布于3'端非編碼區的具體情況考慮，推測這些非同位SNPs集中分布于3'端非編碼區可能有利于調節preproEGF的組織特異性表達，也即可能與preproEGF的表達調控有關[12]。
與在基因組序列的分布相比較，SNPs在preproEGF多肽mRNA/cDNA序列中之分布顯示出較為明確的差異和不甚清晰的相似之處。首先，差異表現在SNPs的種類和數量方面。具體地說，也即分布于preproEGF基因組序列的SNPs包含有近35%的亞SNPs和65%的RefSNPs；而在兩類mRNA/cDNA序列內，其所包含的亞SNPs卻很少（僅占比SNPs約8%），絕大多數為RefSNPs（占比SNPs約92%）。其次，粗看表1、2結果感覺SNPs在mRNA/cDNA序列中的分布雜亂無章而與其在基因組序列中的分布規律毫無共通之處，然而細致觀察卻可見到SNPs在這兩種序列中的分布仍有些許相似之處，具體表現在：①如果以200 bp相鄰SNP間距劃線為界即可見有少數SNPs（相鄰間距>200 bp）是呈不均等散布于mRNA/cDNA序列中的；②SNPs在1～24外顯子區段呈現出以外顯子6～8、11～12、16～19和22～23為間隔而集合分布在第1～5、10、13～15、20～21和第24外顯子中的特征也與其在基因組序列中呈富集叢簇分布的特征頗為相似[5]。此外，總觀圖1（封三）的SNPs分布還可見其在mRNA/cDNA序列中有一個從5'端往3'端逐漸密集分布以至緊密排列的特征，不過其生物學意義尚待研究。
合并表1、2所列資信繪制而成的SNPs分布圖令其在兩類preproEGF多肽mRNA/cDNA序列中之分布情形顯得較為直觀簡明，易于理解，可為SNP與疾病的相關性研究提供便捷之信息支撐，對其他醫學應用和實驗研究也具有參考價值。
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關鍵詞：生物信息學；教材；師范院校
20世紀80年代末以來，生物信息學以驚人的發展速度，獲得了很多突破性成就，正日益成為生命科學在21世紀發展的核心內容。對于未來生物科學中堅力量的現代生物科學工作者而言，掌握生物信息學的相關知識尤為重要。
作為一門新興的課程，生物信息學課程在全國很多高等院校都已經開設，并進行了一些卓有成效的探索和改革。我們結合自身的教學實踐和相關學校的教學現狀，對師范院校生物信息學課程教學內容、師資力量、教學模式和方法、跨學科合作、教學實踐實施情況等方面的現狀進行了積極分析和思考。目前，師范院校生物信息學教學的現狀如下。
一、教學內容陳舊、教學資源缺乏
生物信息學是一門新興的學科，在高等院校開設時間較晚，我國對生物信息學專業精品課程的建設方面投入不夠，成熟的生物信息學教學大綱、教案、多媒體課件、教學視頻和習題等教學資源稀少。目前，市場上也缺乏相關的生物信息學教學多媒體課件和音像制品輔導材料等相關產品，造成生物信息學教學資源匱乏的現狀。
目前師范院校所用教材大多數是徐程主編的《生物信息與數據處理》，蔣彥等編著的《基礎生物信息學及應用》等幾種不同版本的教材。這些教材在知識性、科學性和系統性方面還行，但是在教學內容的新穎性、時效性和實踐性以及生物相關背景的介紹和對師范院校的適用性等方面有所欠缺。生物信息學的知識日新月異，新的數據庫、新的軟件、新的算法層出不窮，而生物信息學的課堂往往不能及時地將最新進展呈現給學生，導致課堂內容陳舊，不利于學生的發展和對生物信息知識的合理掌握，從而影響了生物信息學教學的質量。
二、師資力量缺乏
生物信息學是一門新興的交叉學科，需要熟練掌握計算機與生物學知識的老師來授課。然而，實際上，由于缺少生物信息學的專業教師，教授該學科的教師多為生物學其他課程兼任，這些老師往往缺乏專門的生物信息學訓練，在知識的傳授和應用方面存在欠缺。與生物信息學教學要求存在著較大的差距，不能很好地滿足教學大綱的要求。另外，師范院校通常將生物信息學作為選修課來開設，該課程在專業建設和人才培養方案中的地位偏低，造成相關部門對師資培養不夠重視。
三、教學模式和方法落后
由于生物信息學課程涉及大量的數據庫和軟件知識，教師普遍采用多媒體教學。而多媒體課件的容量通常很大，學生忙于筆記，難以把握重難點。同時，幻燈片展示的知識點猶如放電影一般一閃而過，學生沒有足夠的時間思考和消化，跟不上教師的進度。教師進行多媒體教學時，往往是一堂課上從頭講到尾，語調缺乏抑揚頓挫，沒有起伏，學生很容易昏昏欲睡。因此，教師雖然使用的是先進的教學工具，采用模式的卻是傳統的灌輸式教學，只管埋頭照本宣科，不管學生接收領悟多少。學生為了達到期末考試標準，只顧死記硬背，這樣的教育讓學生失去創新精神和主動思考的能力，失去對生物信息課程的興趣。
四、缺乏與相關學科的合作交流
生物信息學實際上是生物學與計算機科學的交叉學科。然而一般高校往往只在生命科學學院開設生物信息學，由生物學老師來擔任授課老師。由于對計算機科學知識的缺乏，導致生物專業教師對生物信息學課程很難深入開展；另一方面，計算機科學專業由于沒有開設生物信息學課程，使學生不能了解到生物信息學的重要性，以及如何使計算機科學更快更好地發揮其在生物信息學中的作用。總的來說，生物信息學課程的建設欠缺相關學科的協作，不能有效地整合資源，不利于培養復合型人才。
五、缺乏實踐教學內容
現有的生物信息學課程也有一些實踐內容，但實踐課時數少，內容相對簡單，缺乏系統完善的實踐過程。教師為學生講授具體知識時，通常只通過多媒體課件演示操作，并沒有為學生設置具體的動手操作步驟。使得學生對信息反饋遲鈍，印象不深刻，不容易掌握方法。生物信息學實踐教學并不需要價格昂貴的實驗設備，只需要一網的電腦和一些相關的分析軟件便可以進行實驗。然而，目前的狀況是，生物信息學課程中真正開展實踐性教學的內容少之又少。
生物信息學的學習是一個長期積累的過程，教學水平的提高也需要在大量的教學實踐中不斷總結和完善。我們通過分析發現，在師范院校生物信息學教學中仍存在很多問題，其原因是多方面的，需要教學工作者進一步深入探討并提出切實可行的策略。
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一、心理因素的分析
現代研究已證明：男生和女生的智能總的來說是相當的，這已成為一個不爭的結論。然而造成女生高中階段物理成績不如男生的原因是什么？究其根本，造成這一嚴峻現實的原因主要是女生的心理問題，如興趣差異、能力差異、性格差異等等。
1. 興趣差異
心理學研究表明，學習興趣的水平對學習效果有較大的影響，在一般情況下男女生學習物理興趣是不同的。女生較富于情感，其活動往往多定向于人，男生的活動傾向比較集中于物（物理學是研究“物”的）。從幼年起女性的興趣和注意中心就是人及其直接的日常生活方面，而使男性感興趣的客體所賴以存在的空間卻是無限的，男生樂于探究且比女生更擅長思考較復雜的問題，男生比女生對物理更感興趣，學習主動性強一些；男生的好奇心比女生強，這種不同的學習興趣自然要影響學習效果。這樣，女生學習物理的態度就比較被動，遇到困難時往往信心不足，從而一定程度上影響了學習物理這門課程的積極性和主觀能動性。
2. 能力差異
能力是在人的先天素質的基礎上，通過后天實踐的鍛煉和學習發展起來的，而男女生在知覺、記憶、想象、語言和思維等方面，都表現有能力上的差異。男生智能更傾向于概括，因而他們能夠較早地發展區分主次的能力。而女生在學習中雖然有較高的準確性，但缺乏整體性和對事物的總體把握。男生在閱讀教材時對插圖、實驗裝置、實驗現象比較注意，而女生更多注意課本中的概念、規律等結論，對實驗現象往往缺乏整體觀念，動手時有部分女生又有膽怯感。物理學科是一門實驗學科，物理概念及其規律是建立在實驗的基礎上，久而久之，女生學習物理的困難就比較明顯，這也是女生學習物理感到困難的主觀原因。男女生在思維發展上的差異，主要表現在深刻性、靈活性、邏輯性和批評性等方面。男生思維多傾向于抽象思維，在思維品質上，無論是思維的深刻性還是靈活性、邏輯性和批判性，一般男生大都優于女生。而在高中物理學習中，抽象思維多于靜態思維，大部分女生對這一思維方式較難適應，從而對學習物理產生了思維上的困難。
3. 心理品質差異
女生情感細膩而缺乏自我肯定易受暗示，很在乎他人的評價，他人的一言一行都可能引起女生的注意，從而影響其自我評價。良好的人際關系應建立在心理相容的基礎上，但女生往往具有戒備心理，心理上互不相容，一遇小事，雙方的關系就往往表現為排斥和摩擦，人際關系較差。另外女生較易感情用事，常把許多精力耗在無謂的人際關系處理上，影響了學業。
4. 其它方面
性發育帶來了困惑和不安。發育早的女孩怕人家議論，發育晚的則會為此不安，甚至擔心有什么毛病，總之，不論高矮胖瘦，女生們多少都會有為體型變化而不安、焦慮，而男生則少了這些麻煩。
二、改進措施
1. 培養女生學習的興趣，增強女生學好物理的自信心。
根據女生的心理特點，教師應注意到自己的作用，做到因材施教，對女生在學習上取得的成功的時候，教師應及時地給予表揚，使她們嘗到成功的樂趣，這樣既能促使她們產生進一步滿足的愿望，又能樹立自信自強的信念，并形成更高的滿足需要的動力機制。教師在復習時可調整教學內容及方法、容量及深度。章節考試結果表明男女生成績差異最大的是《動量》、《機械能》兩章。在平時的教學中，還要多提問女生，多開展演示實驗，組織興趣小組。同時要通過多種方式和途徑，全方位地真實地掌握女生的心理實情，以對癥下藥。這樣就能提高女生學習物理的興趣，產生積極的學習動力。
2. 注意教學的直觀性。
高中物理在研究復雜物理現象時，為了使問題簡化，經常只考慮其主要因素而忽略其次要因素，建立物理的模型，使物理概念和規律抽象化。例如，把物體當成質點來研究物體做勻變速直線運動時，不少女生對即時速度、加速度等物理量感到很抽象。我們可以通過氣墊導軌和數字計數器測定滑塊的既時速度和加速度，使學生能夠通過具體的物理現象來建立物理概念，提高女生的變通能力和靈活性，使其克服悟性不夠的缺點，讓感性認識上升到理性認識。
3. 加強觀察力的培養。
女生對周圍的事物的觀察往往缺乏針對性，缺乏整體觀念。比如說，燈泡是大家很熟悉的，但很多女生都沒有注意到燈泡的兩個通電觸腳，在用萬用表測燈泡電阻的學生實驗中，很多女生測燈頭上兩個卡腳間的電阻。再如變阻器的連接中，很多女生往往會連在上面或下面兩個接線上使變阻器電阻為零或為定值電阻。
物理學是一門以實驗為基礎的科學，而實驗活動的第一個特點就是有目的地觀察。
三、結果分析與討論
通過對策的實施，大部分女生的自信心、學習方法、學習物理興趣大大增強，心理承受能力、組織活動能力、抽象思維能力得到加強，部分女生的人際關系不良、性情狐僻、怪異、猜疑、緊張焦慮癥得到改善，大部分女生變得熱情、開朗而富有朝氣，鉆研精神也大大提高。
這樣就可以增強她們的自信心，避免形成自卑感，達到蘇霍姆林斯基所言的“讓每個孩子都能抬起頭來走路”的教學境界，最終使學生得到全面發展。
綜上所述，已初步得出了高中女生學習物理的成績差異的心理因素和對策，探索出了女生心理問題在學習物理上的可行性路子，使高中女生的學習物理的心理素質得到了顯著的提高，促進了她們學習物理的興趣和信心。
參考文獻：